LC3A/B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体 |细胞信号技术

来自 : 发布时间：2025-06-11

class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesLC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。\">RRecombinant×What is a 重组抗体及其重要性？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括出色的批次间一致性、连续供应和无动物生产。因此，重组抗体的需求正在增加用于科学研究，尤其是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物。它们是e 通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统易受遗传漂变和不稳定性的影响，增加减轻批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从转染宿主的组织培养上清液中纯化宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb#12741Reviews ()Citations (1000 )Filter:WBIHCIFF使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 对未经处理 (-) 或经 Torin 1 处理（250 nM，4 小时；+）的 RD 细胞提取物进行蛋白质印迹分析.显示更少显示更多 HeLa, NIH 提取物的蛋白质印迹分析/3T3 和 KNRK 细胞，未经处理 (-) 或经氯喹处理（50 μM，过夜；+），使用 LC3A/B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体。显示更少显示更多 免疫组化分析使用 LC3A/B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体的石蜡包埋小鼠前列腺。显示更少显示更多 对石蜡包埋的 NIH/3T3 细胞沉淀、对照（左）或氯喹处理（右）进行免疫组化分析), 使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb.S如何 LessShow More 在对照肽（左）或抗原特异性肽（右）存在的情况下，使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌进行免疫组织化学分析.Show LessShow More 对用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb #12741（左，绿色）标记并与 GFAP (GA5) Mouse 共同标记的固定冷冻小鼠小脑进行共聚焦免疫荧光分析mAb #3670（右，红色）和 DAPI #4083（右，蓝色）。显示更少显示更多 对固定的冷冻小鼠脑桥进行共聚焦免疫荧光分析，用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb #12741（左图，绿色）和 co-标记有 GFAP (GA5) Mouse mAb #3670（右，红色）和 DAPI #4083（右，蓝色）。显示更少显示更多 HeLa（上）和 C2C12（下）细胞的共聚焦免疫荧光分析、氯喹处理（50 μM，过夜；左）、使用 EBSS 进行营养饥饿（3 小时，中）或使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb（绿色）和 β-肌动蛋白 (13E5) 未处理（右）兔单克隆抗体（Alexa Fluor® 555 偶联物）#8046（红色）。蓝色伪彩色 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。显示更少显示更多 使用 LC3A/B (D3U4C) Rabbit mAb 对未经处理（蓝色）或用氯喹（50 µM，16 小时；绿色）处理的 HeLa 细胞进行流式细胞术分析。 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414 用作二抗。显示更少显示更多图片库详细了解我们如何获取图像 × LC3A/B ( D3U4C) XP® Rabbit mAb 12741 Toggle Between Dark and Light ModesFilter:WBIHCIFF 使用 LC3A/B ( D3U4C) XP® 兔单克隆抗体。蛋白质印迹分析使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 提取未经处理 (-) 或氯喹处理（50 μM，过夜；+）的 HeLa、NIH/3T3 和 KNRK 细胞提取物。 使用 LC3A/B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体对石蜡包埋的小鼠前列腺进行免疫组织化学分析。 使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 对对照（左）或氯喹处理（右）的石蜡包埋的 NIH/3T3 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。 免疫组化l 在对照肽（左）或抗原特异性肽（右）存在的情况下，使用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 分析石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌。 固定冷冻小鼠小脑的共聚焦免疫荧光分析，用 LC3A/B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体 #12741（左，绿色）和 GFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体 #3670（右，红色）共同标记和 DAPI #4083（右，蓝色）。 对用 LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb #12741（左，绿色）标记并与 GFAP (GA5) Mouse mAb #3670（右，红色）共同标记的固定冷冻小鼠脑桥进行共聚焦免疫荧光分析和 DAPI #4083（右，b卢）。 HeLa（上图）和 C2C12（下图）细胞的共聚焦免疫荧光分析，这些细胞经过氯喹处理（50 μM，过夜；左图），使用 EBSS 进行营养缺乏（3 小时，中图）或使用 LC3A/未处理（右图） B (D3U4C) XP® 兔单克隆抗体（绿色）和 β-肌动蛋白 (13E5) 兔单克隆抗体（Alexa Fluor® 555 偶联物）#8046（红色）。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。 使用 LC3A/B (D3U4C) 兔单克隆抗体对未经处理（蓝色）或经氯喹（50 µM，16 小时；绿色）处理的 HeLa 细胞进行流式细胞分析。抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414 用作二抗。采购e #12741 目录。 #SizeQty.Price12741T20µl$14712741S100µl$352

ADD TO BASKET® Rabbit mAb\" class=\"btn btn-link btn-block\">自定义配方

Antibody GuaranteeFAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS：Choose Your RegionAmerica-EnglishEurope-ChineseEurope-DutchEurope-EnglishEurope-FrenchEurope-GermanEurope-ItalianEurope-KoreanEurope-PortugueseEurope-SpanishEurope-SwedishCertificate of AnalysisSupporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYH M RSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)14, 16Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-免疫沉淀IHC-免疫组织化学ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品偶联物

产品信息

产品使用信息ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000免疫组化（石蜡）1:250 - 1:1000免疫荧光（冷冻）1:50 - 1:200 免疫荧光（免疫细胞化学）1:50 - 1:200 流式细胞术（固定/透化）1:100 - 1:400储存以 10 mM 钠 HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和小于 0.02% 的叠氮化钠。储存于 –20°C。不要等分抗体。有关本产品的无载体（无 BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #58139。方案选择您的方案Western BlottingImmunohistochemistry（石蜡）免疫荧光（冷冻）免疫荧光（免疫细胞化学）Flow 细胞计数（固定/透化）PRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、 0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动，过夜。

注意：有关推荐的抗体稀释度，请参阅一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积 30X DTT 至 1 体积 3X SDS l加载缓冲区。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。孔径 0.2 µm 是 ge强烈推荐。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质 ladder (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量是推荐的

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物封闭缓冲液轻轻搅拌 1 小时t 室温。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

免疫组织化学（石蜡）A。溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

二甲苯。乙醇，无水变性，组织学级（100% 和 95%）。去离子水 (dH2O)。苏木精（可选）。洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：要制备 1L 1X TBST，将 100ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 添加至 900 ml dH20，混合。SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。1X Citrate Unmasking Solution：制备 250 mL 1X 柠檬酸盐暴露溶液，用 225 mL dH2O 稀释 25 mlof SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)。3% 过氧化氢：要制备 100 ml，将 10 ml 30% H2O2 添加到 90 mldH2O。封闭溶液：TBST/5 % Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution.TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH2O 添加1 ml 无动物封闭溶液 (5X) (#15019)。检测系统：SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔 #8114）。底物：SignalStain® DAB 底物试剂盒 (#8059)。苏木精：苏木精 (#14166 ).Mounting Medium：SignalStain® Mounting Medium (#14177).B.脱石蜡/再水化

注意：在此过程中任何时候都不要让载玻片变干。

脱石蜡/水合e 切片：切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。切片在 95% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每个 5 分钟。抗原去掩蔽

对于柠檬酸盐：在微波中加热载玻片，浸没在 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液中，直到开始沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下 10 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。

D.染色 在 dH2O 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在 3% 过氧化氢中孵育切片 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。用 100–400 µl 封闭每个切片1 小时的首​​选封闭溶液在室温下处理 1 小时。去除封闭溶液并向每个切片添加 100–400 µl 用 SignalStain® AntibodyDiluent (#8112) 稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。将 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）平衡至室温去除抗体溶液并用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。根据需要用 1-3 滴 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB 显色剂浓缩液加入 1 ml SignalStain® DABDiluent 中，并在使用前充分混合。应用 100–将 400 µl SignalStain® DAB 加入每个切片并密切监测。 1–10 分钟通常可提供可接受的染色强度。将载玻片浸入 dH2O 中。如果需要，用苏木精 (#14166) 对切片进行复染。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。脱水切片：将切片在 95% 乙醇中孵育两次每次 10 秒。在 100% 乙醇中重复，将切片孵育两次，每次 10 秒。在二甲苯中重复孵育切片两次，每次 10 秒。用盖玻片和封固剂 (#14177) 封固切片。检测试剂/底物兼容LITYRECOMMENDED 检测试剂SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔）#8114SignalStain® Boost IHC 检测试剂（AP，兔）#18653COMPATIBLE CHROMOGENSignalStain® DAB Substrate Kit #8059SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713SignalS tain® Vivid Purple 过氧化物酶底物试剂盒 # 96632SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644

注意：使用本方案中指定以外的检测试剂可能需要进一步优化一抗考虑到检测试剂的不同灵敏度。

2010 年 2 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：283 免疫荧光（具有柠檬酸盐回收的冷冻组织）A。溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X Phosphate 缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混合。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的小瓶并将打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。1X 柠檬酸盐暴露溶液：准备250 mL 1X 柠檬酸盐暴露溶液，用 225 mL dH2O 稀释 25 ml SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)。封闭缓冲液：（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100） ：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425) 至 9.5 ml 1X PBS）并充分混合。搅拌时，添加 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液：（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS。充分混合，然后加入 0.1 g BSA (#9998)，混合。推荐的荧光染料偶联的抗小鼠二抗：抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 488 偶联物）#4412Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 555 偶联物）#4413Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 594 偶联物）# 8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414注意：首次使用任何一抗或荧光染料偶联的二抗时，滴定抗体以确定哪种稀释度允许Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961).B.标本制备和抗原修复

注意：将传统的抗原修复程序应用于固定冷冻组织可能会导致切片从载玻片上过度释放。强烈建议用户使用促进组织粘附的试剂（例如 HistoGrip™）预处理载玻片，同时将取出温度降至 70°C。

对于在 -80°C 下储存的组织：从冰箱中取出并在 -20°C 下平衡约 15尝试切片前几分钟。这可以防止切片时块破裂。切片组织在 6-20 µm 范围内并放置在带正电的载玻片上。在载玻片加热器上以 60°C 烘烤 1 小时（这有助于切片粘附载玻片）。浸没载玻片在 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，并在约 70°C 的温度下保持 20 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。在 1X PBS 中短暂冲洗切片。免疫染色

注意：所有后续孵育都应除非另有说明，否则在室温下进行，除非另有说明，否则应在潮湿的避光盒或有盖培养皿/平板中进行，以防止干燥和荧光染料褪色。

在封闭缓冲液中封闭样品 60 分钟。封闭时，通过稀释作为抗体稀释缓冲液在产品网页上的方案中注明。吸出封闭溶液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在荧光染料偶联的秒中孵育样本干抗体在抗体稀释缓冲液中稀释，室温避光 1-2 小时。用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI 盖玻片(#8961)。为获得最佳效果，请让封固剂在室温下过夜固化。如需长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2017 年 10 月发布

方案 ID：1569

免疫荧光（免疫细胞化学）A .溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或等效纯化水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O，混匀。将 pH 值调整至 8.0。甲醇、100% 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)) 和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。尽管搅拌，添加 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS。混合均匀，然后加入 0.1 g BSA (9998)，混合。

推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor ® 488 偶联物）#4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor ® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961 ).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后覆盖细胞以用冰冷的 100% 甲醇固定 2-3 毫米的深度。让细胞在 -20°C 下固定 15 分钟。吸出固定剂，冲洗 3 次在 1X PBS 中，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：除非另有说明，否则所有后续孵育均应在室温下进行，以防止干燥和荧光染料褪色。

在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟. 封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在荧光染料中孵育样本- 在抗体稀释缓冲液中室温避光稀释偶联二抗 1-2 小时。按照步骤 5 在 1X PBS 中冲洗。用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI ( #8961）。为获得最佳结果，请立即使用适当的激发波长检查样本。如需长期储存，请将载玻片平放在 4°C 保护下从光中提取。

2010 年 12 月发布

方案 ID：3

流式细胞术，用于 RabbitAntibodiesA 的甲醇透化方案。溶液和试剂

本方案所需的所有试剂都可以在我们的细胞内流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593 中有效地一起购买，或者使用下面列出的目录号单独购买。

注意：使用反渗透制备溶液去离子 (RODI) 或同等级别的水。

1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇(#47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷藏抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 制备 0.5% BSA PBS 缓冲液) (#9998) 溶于 100 ml 1X PBS。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 594 偶联物）#8889抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 647 偶联物）# 4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当您的实验中包含荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参阅到推荐协议的染料产品页面。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。一般来说，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：可以在固定之前添加针对 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体n 如果表位被甲醛和/或甲醇破坏。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢添加到预冷的细胞中来透化细胞，同时轻轻涡旋，直至最终浓度90% 甲醇的处理。在冰上透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或将细胞储存在 -20°C 的 90% 甲醇中。D.免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

将所需数量的细胞等分到试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在 Antibo 中离心洗涤dy 稀释缓冲液或 1X PBS。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

Specificity / SensitivityLC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb 可识别总 LC3A 和 LC3B 蛋白的内源水平。物种反应性：

Human, Mouse, Rat

根据 100% 序列同源性预测会发生反应的物种：用于生产该抗体的抗原序列与此处列出的物种具有 100% 序列同源性，但 CST 尚未测试或确认反应性有效。将本产品用于这些物种不涵盖在我们的抗体性能保证中。

非洲爪蟾、牛、狗、猪

来源/纯化

单克隆抗体是通过使用合成抗体对动物进行免疫而产生的人LC3B蛋白Leu44周围残基对应的肽（在LC3A中保守）。

背景和

自噬是大量细胞质内容物自噬体-溶酶体降解的分解代谢过程 (1,2)。自噬通常在营养缺乏的情况下被激活，但它也与许多生理过程相关，包括发育、分化、神经退行性疾病、感染和癌症 (3)。自噬标记物轻链 3 (LC3) 最初被鉴定为微管相关蛋白 1A 和 1B（称为 MAP1LC3）的一个亚基 (4)，随后发现其与对自噬至关重要的酵母蛋白 Apg8/Aut7/Cvt5 具有相似性 (5) .三种人类 LC3 亚型（LC3A、LC3B 和 LC3C）在自噬过程中经历翻译后修饰 (6-9)。合成后立即在羧基末端切割 LC3，产生胞质 LC3-I 形式。在自噬过程中，LC3-I 通过涉及 Atg7 和 Atg3 的泛素样系统脂化转化为 LC3-II，从而使 LC3 与自噬相关联c 囊泡 (6-10)。自噬体中 LC3 的存在以及 LC3 向较低迁移形式 LC3-II 的转化已被用作自噬的指标 (11)。

Reggiori, F. 和 Klionsky, D.J. (2002) 真核生物。 Cell 1, 11-21.Codogno, P. 和 Meijer, A.J. (2005) 细胞死亡不同。 12 增刊 2, 1509-18.Levine, B. 和 Yuan, J. (2005) J. Clin。投资。 115, 2679-88.Mann, S.S. 和 Hammarback, J.A. (1994) J. Biol。化学。 269, 11492-97.Lang, T. 等人。 (1998) EMBO J. 17, 3597-607.Kabeya, Y. 等人。 (2000) EMBO J. 19, 5720-28.He, H. 等。 (2003) J. Biol。化学。 278, 29278-87.Tanida, I. 等人。 (2004) J. Biol。化学。 279, 47704-10.Wu, J. 等。 (2006) 生物化学。生物物理学。水库。公社。 339, 437-42.Ichimura, Y. 等人。 (2000) Nature 408, 488-92.Kabeya, Y. 等人。 (2004) J. 细胞科学。 117, 2805-12.Pathways

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STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

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UniProt ID：Q9H492，Q9GZQ8

Entrez-Gene Id:84557, 81631

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