Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体 |细胞信号技术

来自 : 发布时间：2025-06-11

class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesCleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、持续供应和无动物制造。\">RRecombinant×什么是重组抗体及其重要性？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括批次间一致性、连续供应和无动物生产。因此，重组抗体是看到越来越多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物国家。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统容易发生遗传漂移，并且在稳定性，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从组织培养上清液中纯化转染的宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，都必须在实验使用前在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb#9664Reviews ()Citations (5493)过滤器：WBIPIHCIFF对未经处理或经 staurosporine #9953（1uM， 3小时）或依托泊苷 #2200（25uM，5 小时），使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb。显示更少显示更多 Simple Western™ 裂解物分析（0.1 mg/ mL) 来自使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664 经细胞色素 C 处理的 Jurkat 细胞。虚拟泳道视图（左）显示了在 1:10 和 1:50 一抗稀释度下的目标条带（如图所示）。相应的电泳图视图（右）绘制了沿毛细管以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）稀释一抗时分子量的化学发光。本实验是在还原条件下使用 12-230 kDa 分离模块在 BioTechne 品牌 ProteinSimple 的 Jess™ Simple Western 仪器上进行的。显示更少显示更多 未经处理的 Jurkat 细胞提取物的免疫沉淀或依托泊苷处理（25uM，5 小时），使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb。使用相同的抗体进行蛋白质印迹。显示更少显示更多\" alt=\"Immunohistochemistry Image 1: Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb\">在对照肽存在的情况下，使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 对石蜡包埋的小鼠胚胎进行免疫组织化学分析（左）或 Cleaved Caspase-3 (Asp175) 阻断肽 (#1050)（右）。显示更少显示更多 使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 对 SignalSlide® Cleaved Caspase-3 IHC Controls #8104（石蜡包埋的 Jurkat 细胞，未处理（左图）进行免疫组织化学分析) 或依托泊苷处理（右））。显示更少显示更多jpg\" alt=\"免疫组织化学图像 3：Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb\">使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 对石蜡包埋的小鼠胚胎进行免疫组织化学染色，显示凋亡细胞的细胞质定位兔单抗。显示更少显示更多1: Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb\">HT-29 细胞的共聚焦免疫荧光图像，未处理（左）或 Staurosporine #9953 处理（右）用 Cl 标记eaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体（绿色）。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。显示更少显示更多 使用 Cleaved Caspase- 对未经处理（蓝色）或经依托泊苷 #2200（绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析3(Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体与非特异性阴性对照抗体（红色）相比。显示更少显示更多图片库了解更多关于我们如何获取图像的信息 × Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体 9664 Toggle Between Dark and Light ModesFilter:WBIPIHCIFF 对来自 C6（大鼠）、NIH/3T3（小鼠）和 Jurkat（人）细胞的提取物进行蛋白质印迹分析，这些细胞未经处理或经 staurosporine #9953（1uM，3 小时）或依托泊苷 #2200（25uM，5 小时）处理，如图所示, 使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体。 alt=\"Western Blotting Image 2: Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb\">Simple Western™ 分析使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) ( 5A1E) Rabbit mAb #9664。虚拟泳道视图（左）显示一抗 1:10 和 1:50 稀释度的目标条带（如图所示）。相应的电泳图视图（右）沿毛细管按分子量绘制化学发光图以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）稀释一抗。该实验在还原条件下在 Pr 的 Jess™ Simple Western 仪器上进行oteinSimple，BioTechne 品牌，使用 12-230 kDa 分离模块。 使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 对未经处理或经依托泊苷处理（25uM，5 小时）的 Jurkat 细胞提取物进行免疫沉淀。使用相同的抗体进行蛋白质印迹。 在对照肽（左）或 Cleaved Caspase-3 (Asp175) 阻断肽 (#1050) 存在的情况下，使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 对石蜡包埋的小鼠胚胎进行免疫组织化学分析） （正确的）。 使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb on SignalSlide® Cleaved Caspase 进行免疫组织化学分析-3 IHC Controls #8104（石蜡包埋的 Jurkat 细胞，未经处理（左）或依托泊苷处理（右））。Immunohistochemical staining of paraffin-embedded mouse embryo, showing cytoplasmic localization in apoptotic cells, using Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体。未处理（左）或 Staurosporine #9953 处理的 HT-29 细胞的共聚焦免疫荧光图像d（右）用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb（绿色）标记。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。 使用 Cleaved Caspase-3(Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 与非特异性阴性对照抗体（红色）相比较，对未经处理（蓝色）或经依托泊苷 #2200（绿色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析。购买#9664Cat。 #SizeQty.Price9664T20µl$1499664S100µl$3799664L300µl$887

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Antibody GuaranteeFAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica-EnglishEurope-ChineseEurope-DutchEurope-EnglishEurope-FrenchEurope-GermanEurope-ItalianEurope-KoreanEurope-PortugueseEurope-SpanishEurope-SwedishCertificate of AnalysisSupporting DataRelated Products产品信息UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYH M R MkSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)17, 19Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-免疫沉淀IHC-免疫组织化学ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB -Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-小鼠R-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D. melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S. cerevisiaeCe-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species ExpectedRelated ProductsConjugates

产品信息

产品使用信息应用稀释Western Blotting1:1000Simple Western™1:10 - 1:50免疫沉淀1:50免疫组织化学（石蜡）1:2000免疫荧光（免疫细胞化学）1:400 - 1:1600流式细胞术（固定/透化）1:6400储存以 10 mM 钠 H 提供EPES（pH 值 7.5）， 150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠。储存于 –20°C。不要等分抗体。有关本产品的无载体（无 BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #94530。方案选择您的方案Western Blotting免疫沉淀免疫组织化学（石蜡）免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）打印

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS、0.1% Tween® 20 中于 4°C 孵育并轻轻摇动, 过夜。

注意：推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。

A.溶液和试剂

不E：用反渗透去离子 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混合.10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中，准备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 毫升，添加 7.5 克 n将脱脂奶粉加入 150 ml 1X TBST 并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。一抗稀释缓冲液：1X TBST 含 5% 脱脂奶粉；对于 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉加入 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心机熔断管。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用抗兔 IgG 孵育膜, HRP-linked Antibody (#7074 at 1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075 at 1:1000–1:3000) 检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物，轻轻搅拌 1室温下 hr。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

协议 ID：263

天然蛋白质的免疫沉淀

该方案旨在利用蛋白 A 琼脂糖珠对天然蛋白质进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过添加 1/10 制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液体积 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。蛋白 A 琼脂糖珠：(#9863).10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）: (#9802) 要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 制备 0.5 ml ATP(200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 添加到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预清除（可选）涡旋混合珠子。将 10–30 µl 50% 蛋白 A 琼脂糖珠浆添加到 200 µl 1 mg/ml 细胞裂解物中。Incu在 4°C 下旋转软化 30-60 分钟。在 4°C 下微量离心 10 分钟。将上清液转移到新试管中。继续进行下面的免疫沉淀。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。对兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，对兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，对小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

添加一抗（以适当的稀释度按照产品数据表中的建议）添加到 200 µl 细胞裂解物中，浓度为 1 mg/ml。在 4°C 下旋转孵育过夜。添加蛋白 A 琼脂糖（10–30 µl 50% 珠浆）。在 4°C 下旋转孵育 1-3 小时。在 4°C 下微量离心 30 秒。用 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次清洗之间保持在冰上。通过蛋白质免疫印迹或激酶活性（D 部分）进行样品分析。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀。涡旋，然后以 14,000 x g 微量离心 30 秒。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。将样品 (15-30 µl) 装入 4-20 % 用于 SDS-PAGE 的凝胶。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：当使用兔中产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mo使用抗兔 IgG（轻链特异性）(D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）作为二抗以最小化变性兔重链产生的干扰。对于分子量在 25 kDa 范围内的蛋白质，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以最大限度地减少变性小鼠轻链产生的干扰。

当使用小鼠产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (# 58802) 作为二抗，以最大限度地减少变性小鼠重链产生的干扰。

通过激酶分析进行分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。孵育 30 分钟在 30°C。使用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一个管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 上 (4–20%)。

2008 年 12 月发布

2021 年 10 月修订

方案 ID：409

免疫组织化学（石蜡）A.溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

二甲苯。乙醇，无水变性，组织学级（100% 和 95%）。去离子水 (dH2O)。苏木精（可选）。洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：要制备 1L 1X TBST，添加 100ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 至 900 ml dH20，混合。SignalStain® 抗体稀释剂（ #8112).1X Citrate Unmasking Solution：要制备 250 mL 1X 柠檬酸盐暴露溶液，请稀释 25 ml SignalStain® Citrate Unmasking Solu用 225 mL dH2O.3% 过氧化氢稀释 (10X) (#14746)：要制备 100 ml，请将 10 ml 30% H2O2 添加到 90 mldH2O 中。封闭溶液：TBST/5% 正常山羊血清或 1X Animal-Free 封闭Solution.TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH2O 添加 1 ml Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。检测系统：SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔 #8114）。底物：SignalStain® DAB 底物试剂盒 (#8059)。苏木精：苏木精 (#14166)。封固剂：SignalStain® 封固剂（ #14177).B.脱石蜡/再水化

注意：在此过程中任何时候都不要让载玻片变干。

切片脱石蜡/水化：切片在二甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。切片在 100% 的洗涤中孵育两次乙醇每次 10 分钟。在 95% 乙醇中孵育切片两次，每次 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。C。抗原去除

对于柑橘吃：将浸没在 1X 柠檬酸盐保护溶液中的载玻片放入微波炉中加热，直至开始沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下 10 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。

D.染色 在 dH2O 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在 3% 过氧化氢中孵育切片 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。用 100–400 µl 封闭每个切片1 小时的首​​选封闭溶液在室温下处理 1 小时。去除封闭溶液并向每个切片添加 100–400 µl 用 SignalStain® AntibodyDiluent (#8112) 稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。将 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）平衡至室温。去除抗体溶液并用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。用 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection 覆盖切片根据需要使用试剂（HRP，兔 #8114）。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。清洗切片用洗涤缓冲液 ee 次，每次 5 分钟。将 1 滴（30 µl）SignalStain® DAB 显色剂浓缩物加入 1 ml SignalStain® DABDiluent 中，并在使用前充分混合。将 100–400 µl SignalStain® DAB 应用于每个切片并密切监测。 1–10 分钟通常可提供可接受的染色强度。将载玻片浸入 dH2O 中。如果需要，用苏木精 (#14166) 对切片进行复染。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。脱水切片：将切片在 95% 乙醇中孵育两次每次 10 秒。在 100% 乙醇中重复，将切片孵育两次，每次 10 秒。在二甲苯中重复孵育切片两次，每次 10 秒。用盖玻片和封固剂 (#14177) 封固切片。检测试剂/底物相容性推荐检测REAGENTSSignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔）#8114SignalStain® Boost IHC 检测试剂（AP，兔）#18653COMPATIBLE CHROMOGENSignalStain® DAB Substrate Kit #8059SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644

注意：使用本协议中指定以外的检测试剂可能需要进一步优化一抗以考虑检测试剂的不同敏感性。

2010 年 2 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id: 283

免疫荧光（免疫细胞化学）A.溶液和试剂

使用我们的 #12727 免疫荧光应用解决方案套件中高效且经济的预制试剂获得更高质量的免疫荧光图像

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 或

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混合。调节 pH 值至 8.0.Formaldehyde：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的打开的小瓶并在 4°C 避光条件下储存，使用时用 1X PBS 稀释。封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3 % Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混合均匀，然后加入 0.1 g BSA (9998)，混合。

推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor ® 488 偶联物）#4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor ® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold Anti带 DAPI 的褪色试剂 (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。

注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：除非另有说明，否则所有后续孵育均应在室温下进行，以防止干燥和荧光染料褪色。

在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟. 封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在1X PBS 每次 5 分钟。在抗体稀释缓冲液中稀释的荧光染料偶联二抗中室温避光孵育样本 1-2 小时。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。盖玻片用 Prolong® Gold Antifade试剂 (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。为获得最佳效果，请让封固剂在室温下过夜固化。对于长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2006 年 11 月发布

2013 年 11 月修订

方案 ID： 24

流式细胞术，兔抗体 A 的甲醇透化协议。溶液和试剂

本方案所需的所有试剂都可以在我们的细胞内流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593 中有效地一起购买，或者使用下面列出的目录号单独购买。

注意：使用反渗透制备溶液去离子水 (RODI) 或同等级别的水。

1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：准备 1 L 1XPBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇 (#47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷藏抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞仪抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当您的实验中包含荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参阅染料产品页面以了解推荐的方案。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：粘附ent 细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以解离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞，同时轻轻涡旋，使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

将所需数量的细胞等分到试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的原代蚂蚁中重悬细胞ibody，在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度或通过滴定法制备。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

Specificity/SensitivityCleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 可检测激活的 caspase-3 的大片段 (17/19 kDa) 的内源水平，该大片段是由与 Asp175 相邻的裂解产生的。该抗体无法识别全长 caspase-3 或其他裂解的 caspase。非特异性标记 m可以通过免疫荧光观察固定冷冻组织中特定亚型健康细胞（例如胰腺 α 细胞）。在人类和猴子样本中可能会观察到细胞质背景。物种反应性：

Human, Mouse, Rat, Monkey

根据 100% 序列同源性预测反应的物种：使用的抗原序列生产此抗体与此处列出的物种具有 100% 的序列同源性，但反应性尚未经过 CST 测试或证实有效。我们的抗体性能保证不涵盖对这些物种使用此产品。

Bovine, Dog, Pig

来源/纯化

使用与人 caspase-3 的 Asp175 相邻的氨基末端残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。 背景

Caspase-3（CPP-32、Apopain、Yama、SCA-1）是细胞凋亡的关键执行者，因为它部分或全部负责蛋白质许多关键蛋白质的裂解，例如核酶聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) (1)。 caspase-3 的激活需要将其无活性酶原蛋白水解加工成激活的 p17 和 p12 片段。 caspase-3 的切割需要 P1 位置的天冬氨酸残基 (2)。

Fernandes-Alnemri, T. 等。 (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.Nicholson, D.W.等。 (1995) Nature 376, 37-43.Pathways

探索与该产品相关的通路。

选择您的通路阿尔茨海默氏病细胞凋亡调节死亡受体信号 ErbB/HER 信号抑制细胞凋亡线粒体控制细胞凋亡×上游/下游蛋白质

STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

关闭数据库链接

UniProt ID：P42574

Entrez-Gene Id：836

®\">在 PhosphoSitePlus®

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