


ADD TO BASKETCustom FormulationAntibody GuaranteeFAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your Region美国-英国欧洲-中国欧洲-荷兰欧洲-英国欧洲-法国欧洲-德国欧洲- 意大利欧洲- 韩国语欧洲 - 葡萄牙语欧洲 - 西班牙语欧洲 - 瑞典语支持数据相关产品产品使用协议背景途径引文和评论支持数据反应性H R Mk灵敏度内源性MW (kDa)45SOURCER兔应用程序密钥:WB-蛋白质印迹IP-免疫沉淀IHC-免疫组织化学ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RU NC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键:H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品
产品信息
产品使用信息ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000免疫沉淀1:50免疫荧光(免疫细胞化学)1:100流式细胞术(固定/透化)1:50StorageSupplied在 10 mM 钠 HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。储存于 –20°C。不要iquot the antibody.ProtocolSelect your ProtocolWestern BlottingImmunoprecipitationImmunofluorescence (Immunocytochemistry)Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized)PRINTView >Collapse >
Western Blotting Protocol对于蛋白质印迹,将膜与稀释的一抗孵育在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中,在 4°C 下轻轻摇动,过夜。
注意:有关推荐的抗体稀释度,请参阅一抗产品网页。
A.溶液和试剂从样品制备到检测,Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit
注意:用反渗透去离子( RODI) 或同等级别的水。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中,混合。10X Tris 缓冲盐水 (TBS): (#12498) 要制备 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O,混合。1X SDS 样品缓冲液:蓝色上样包 (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中,混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液:(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):(#9997) 要制备 1 L 1X TBST:添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O,混合。脱脂奶粉:(#9999)。封闭缓冲液:1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉;对于 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA):(#9998)。一抗稀释缓冲液:1X TBST 与 5 %牛血清白蛋白;对于 20 ml,将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包:(#7727)。蓝色预染蛋白标记物,宽范围 (11-250 kDa):(#59329). 印迹膜和纸:(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗:抗兔 IgG,HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂:SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞;吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA(以降低样品粘度)。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟;在冰上冷却。微量离心 5 分钟。将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶(10 厘米 x 10 厘米)上。
注意:上样预染分子量标记(#59329,10 µl/车道)建议验证电转移和生物素化蛋白质阶梯(#7727,10 µl/泳道)以确定分子量。
电转移到硝酸纤维素膜(#12369)。C。膜封闭和抗体孵育注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,相应地调整体积。
I.膜封闭(可选) 转移后,在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。二。一抗孵育在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗(按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂),在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。用 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody(#7074,1:2000)和抗生物素、HRP-linked Antibody 孵育膜(#7075,1:1000–1:3000)以在室温下轻轻搅拌 1 小时,检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白质标记物。用 15 ml TBST 洗涤 3 次,每次 5 分钟。继续检测 ( D.D 部分蛋白质检测使用说明:在 TBST 中将膜结合的 HRP(抗体偶联物)洗涤 3 次,每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B(例如,用于 10毫升,加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B)。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟,去除多余的溶液(膜保持湿润),用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。* 避免反复接触皮肤。
2005 年 6 月发布
2020 年 6 月修订
方案 ID:10
天然蛋白质的免疫沉淀本方案是用于天然蛋白质的免疫沉淀,以利用蛋白 A 磁性分离通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析
A.溶液和试剂注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS,添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O,混合。10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O,混合。
注意:在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。
3X SDS 样品缓冲液:蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过添加 1/10 制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液体积 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。蛋白 A 磁珠:(#73778)。磁性分离架:(#7017) 或 (#14654)。10X 激酶缓冲液(用于激酶测定):(#9802)准备 1 ml 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O 中,混合 ATP (10 mM)(用于激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM),添加 10 µl ATP (10 mM) 至 490 µl 1X 激酶缓冲液。B.准备细胞裂解物吸出培养基。治疗细胞通过在所需时间添加含有调节剂的新鲜培养基。要在非变性条件下收获细胞,去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次,每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟,并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要,可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预澄清(可选)强烈推荐细胞裂解物预澄清步骤,以减少非特异性蛋白质与 Protein A 磁珠的结合。预澄清足够的裂解物用于测试样品和同种型对照。
短暂涡旋储存管以重悬磁珠。重要:使用前预洗 #73778 磁珠:
转移 20微升珠浆到干净的管中。将试管置于磁力分离架上 10-15 秒。溶液澄清后小心取出缓冲液。向磁珠沉淀中加入 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液,短暂涡旋以清洗磁珠。将管放回磁力分离架。解决方案澄清后取出缓冲液。再次重复洗涤步骤。
将 200 μl 细胞裂解物添加到 20 μl 预洗磁珠中。重要提示:最佳裂解物浓度将取决于目标蛋白质的表达水平。建议起始浓度在 250 μg/ml-1.0 mg/ml 之间。
在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架将珠子与裂解物分离,将预澄清的裂解物转移到清洁试管,并丢弃磁珠沉淀。继续进行免疫沉淀部分。免疫沉淀重要提示:强烈建议使用适当的同种型对照,以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。我们e Normal Rabbit IgG #2729 用于兔多克隆一抗,Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠单克隆 IgG1 一抗,Mouse (E5Y6Q ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗,Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。
将一抗(按照产品数据表中推荐的适当稀释度)添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。形成免疫复合物。预洗磁珠(参见细胞裂解物预清除部分,步骤 1 和 2)。将裂解物和抗体(免疫复合物)溶液转移到装有预洗磁珠的试管中tic 珠粒。在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架沉淀珠粒。用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次洗涤之间保持在冰上。继续通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析(D 部分)。样品分析继续执行以下一组特定步骤。
通过蛋白质免疫印迹分析用 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物,短暂涡旋混合,然后短暂微量离心以沉淀样品。将样品加热至 95-100°C,持续 5 分钟。使用磁力分离架沉淀珠粒。将上清液转移到新管中。上清液即为样品。通过蛋白质印迹法分析样品(参见蛋白质免疫印迹实验步骤)。注意:为尽量减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 引起的掩蔽,我们建议使用小鼠抗兔 IgG(轻链特异性)(D4W3E) mAb (#45262) 或小鼠抗兔 IgG(构象特异性)(L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 偶联物#5127)。为尽量减少变性 IgG 轻链 (~25 kDa) 引起的掩蔽,我们建议使用小鼠抗兔 IgG(构象特异性)(L27A9) mAb (#3678)(或 HRP 偶联物 #5127)。
用于分析激酶测定 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中,辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋,然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟,然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 凝胶上。2008 年 12 月发布
2021 年 4 月修订
方案 ID:410
免疫荧光(免疫细胞化学)A。溶液和试剂使用我们 #12727 Immunofluoresce 中高效且经济的预制试剂获得更高质量的免疫荧光图像nce 应用解决方案套件
注意:使用反渗透去离子 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):(9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O,混匀。将 pH 值调节至 8.0。甲醛:16%,不含甲醇,Polysciences, Inc.(目录号 18814),使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存,在 1X PBS 中稀释以备使用。封闭缓冲液(1X PBS / 5 % 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清(例如,Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O,混合均匀。搅拌的同时,加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液(1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混合均匀,然后加入 0.1 g BSA (9998),混合。推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗:
抗兔 IgG (H+L),F(ab\')2 片段(Alexa Fluor ® 488 偶联物)#4412Anti-Rabbit IgG (H+L),F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 片段(Alexa Fluor® 647 偶联物)#4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)注意:细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。
吸出液体,然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。
注意:甲醛有毒,只能在通风橱中使用。
让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂,用 1X PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。继续进行免疫染色(C 部分)。免疫染色注意:除非另有说明,否则所有后续孵育均应在室温下进行,以防止干燥和荧光染料褪色。
块样本在封闭缓冲液中 60 分钟。封闭时,按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液,应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5每次 min。在抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中孵育样本 1-2 小时,室温避光。在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。盖玻片用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071 ) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。为获得最佳效果,请让封固剂在室温下过夜固化。对于长期储存,请将载玻片平放于 4°C 避光保存。2006 年 11 月发布
2013 年 11 月修订
方案 ID: 24
流式细胞术,兔抗体 A 的甲醇透化协议。溶液和试剂本方案所需的所有试剂都可以在我们的网站上一起高效购买细胞内流式细胞术试剂盒(甲醇)#13593,或单独使用下面列出的目录号。
注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等等级的水制备溶液。
1X 磷酸盐缓冲盐水(PBS) ):要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛,无甲醇 (#47746)100% 甲醇 (#13604):使用前冷藏抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或通过将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (PE Conjugate) #79408注意:当包含荧光细胞染料时在您的实验中(包括活性染料、DNA 染料等),请参考染料产品页面以了解推荐的方案。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。
B.固定注意:贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。
注意:最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常,150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。
注意:如果使用全血,裂解红细胞并在固定前离心洗涤。
注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,抗体将保持与目标靶标的结合。但是,请注意一些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此透化前不得添加。如果您不确定,请进行小规模实验。
离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者,细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞,同时轻轻涡旋,使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色(D 部分)或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色注意:使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。
等分所需的细胞数量放入试管或孔中。 (通常,每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。)通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞(按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备)。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。2009 年 7 月发布
2020 年 6 月修订
Protocol Id : 404
特异性/灵敏度Phospho-MEK1 (Thr286) 抗体检测内源水平的苏氨酸 286 磷酸化的 MEK1。该抗体不会与磷酸化的 MEK2 发生交叉反应。物种反应性:人类、大鼠、猴子
预计会发生反应的物种基于 100% 序列同源性:用于生产该抗体的抗原序列与此处列出的物种具有 100% 序列同源性,但反应性尚未经过 CST 测试或确认有效。我们的抗体性能保证不涵盖对这些物种使用该产品.小鼠
来源/纯化多克隆抗体是通过使用与人 MEK1 的 Thr286 周围残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种而产生的。抗体通过蛋白 A 和肽亲和层析纯化。
背景MEK1 和 MEK2,也称为 MAPK 或 Erk 激酶,是双特异性蛋白激酶,在丝裂原活化蛋白激酶级联控制中发挥作用细胞生长和分化 (1-3)。 MEK1 和 MEK2 的激活是通过 Raf 样分子磷酸化 217 和 221 位的两个丝氨酸残基而发生的,这两个丝氨酸残基位于亚域 VIII 的激活环中。 MEK1/2 被多种生长因子和细胞因子以及膜去极化和钙内流激活 (1-4)。组成型活性形式的 MEK1/2 足以转化 NIH/3T3 细胞或分化 PC-12 细胞 (4)。 MEK 通过磷酸化位于激酶亚结构域 VIII 激活环内位点的苏氨酸和酪氨酸残基来激活 p44 和 p42 MAP 激酶。MEK1 在 Ser298 位点被 PAK1 磷酸化,从而促进从 Raf 到 MEK1 和 Erk2 的信号转导 (5-7)。 MEK1 也被有丝分裂细胞中 Thr286 位点的 cdk5 磷酸化,导致 p44/42 MAP 激酶通路的负反馈 (8)。
Crews, C.M.等。 (1992) 科学 258, 478-480.Alessi, D.R.等。 (1994) EMBO J. 13, 1610-19.Rosen, L.B.等。 (1994) Neuron 12, 1207-21.Cowley, S. 等人。 (1994) Cell 77, 841-52.Xu, B. 等。 (1999) 生物学杂志。化学。 274, 34029-34035.Coles, L.C.和 Shaw, P.E. (2002) Oncogene 21, 2236-2244.Eblen, S. T. 等人。 (2002) 摩尔。细胞。生物学。 22, 6023-6033.Sharma, P. 等人。 (2002) J. Biol。化学。 277, 528-534.Pathways探索与该产品相关的通路。
选择您的通路肌动蛋白动力学血管生成B 细胞受体信号转导ESC 多能性和分化ErbB/HER 信号转导GPCR 信号转导至MAPKs生长和分化通过MAPKs IL6 信号转导胰岛素受体信号转导T 细胞受体信号转导Warburg 效应×上游/下游蛋白质STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。
关闭数据库链接UniProt ID:Q02750
Entrez-Gene Id:5604
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