NF-κB p65 (D14E12) XP® 兔单克隆抗体 |细胞信号技术

来自 : 发布时间：2025-06-11

class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesNF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、持续供应和无动物制造。\">RRecombinant×What是一种重组抗体，为什么它很重要？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。因此，重组抗体正在更多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物。y 是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统易受遗传漂变和不稳定的影响，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化，而重组抗体则从 transfe 的组织培养上清液中纯化cted 宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb#8242Reviews ()Citations ( 4583) 过滤器：WBIPIHCIFFChIPC&R使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。显示更少显示更多 Simple Western™ 对 HeLa 细胞裂解物 (1 mg/mL) 的分析使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242。虚拟泳道视图（左）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单个目标条带（如图所示）。相应的电泳图视图（右） ) 以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）稀释的一抗绘制了沿毛细管的化学发光图。该实验是在还原条件下在来自 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行的，使用 12-230 kDa 分离模块。显示更少显示更多alt=\"免疫沉淀图像 1：NF-κB p65 (D14E12) XP® 兔单克隆抗体\">CHO 细胞提取物中 NF-kB p65 的免疫沉淀。泳道 1 为 10%输入，泳道 2 使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb, #8242。使用 NF-κB p65 (L8F6) 进行蛋白质印迹) Mouse mAb, #6956.显示更少显示更多=\"免疫组织化学图像 1：NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb\">使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对 SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls #12873（石蜡包埋的 HCT116 细胞）进行免疫组织化学分析，未经处理（左）或经 hTNF-α #8902（右）处理。显示更少显示更多 使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® 对石蜡包埋的人慢性胆囊炎进行免疫组织化学分析兔子mAb.Show LessShow More 使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb（绿色）对未经处理（左）或经 hTNF-α #8902（20 ng/ml，20 分钟）（右）处理的 HT-1080 细胞进行共聚焦免疫荧光分析)。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色假彩色 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。显示更少显示更多 使用 NF-κB p65 对 HeLa 细胞进行流式细胞术分析(D14E12) XP® Rabbit mAb（蓝色）与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（红色）相比。显示更少显示更多 使用经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF- 处理的 HeLa 细胞的交联染色质进行染色质免疫沉淀κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了 IL-8 的结合，IL-8 是 NFκB 的已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。如需其他 ChIP-seq 轨道，请下载产品数据表。显示更少显示更多 使用 hTNF-α #8902（30 ng/ml，30 ng/ml， 1 小时) 和 NF-κB p65 (D14E12) XP® 兔单克隆抗体，美国ing SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨染色体 4（上）的结合，包括 IL-8（下），一种已知的 NFκB 靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 染色质免疫沉淀是使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 处理的 HeLa 细胞的交联染色质进行分析套件（磁珠）#9003。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers # 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量4486. 每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。显示更少显示更多 使用经 hTNF 处理的 HeLa 细胞进行 CUT&RUN -α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 LAMC2 的结合，LAMC2 是 NF-κB p65 的已知靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 CUT&RUN 对 HeLa 细胞进行了处理hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。这些图显示了跨 1 号染色体（上图）的结合，包括 LAMC2（下图），一种已知的 NF-κB p65 靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 CUT&RUN使用经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 处理的 HeLa 细胞进行，使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652。使用人 LAMC2 上游引物和人 ITM2A 上游引物通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样品中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质的总量，相当于一个。显示更少显示更多图片库了解更多关于我们如何获取图像的信息 × NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 8242 Toggle Between Dark and Light ModesFilter:WBIPIHCIFFChIPC&R 蛋白质印迹使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对不同细胞系的提取物进行印迹分析。 Simple Western™ 使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 对 HeLa 细胞的裂解物 (1 mg/mL) 进行分析。虚拟泳道视图（左）显示了单一目标条带（如图所示），一抗稀释度为 1:10 和 1:50。对应的电泳图（右）以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）的一抗稀释度沿毛细管按分子量绘制化学发光图。该实验在还原条件下使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行。 CHO 细胞提取物中 NF-kB p65 的免疫沉淀。泳道 1 是 10% 输入，泳道 2 使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 沉淀，泳道 3 是 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb, #8242。使用 NF 进行蛋白质印迹-κB p65 (L8F6) 小鼠单克隆抗体，#6956。 免疫组化分析使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对 SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls #12873（石蜡包埋的 HCT116 细胞，未经处理（左）或经 hTNF-α #8902（右）处理）进行分析。 使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人慢性胆囊炎进行免疫组织化学分析。 使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit 对未经处理（左）或经 hTNF-α #8902（20 ng/ml，20 分钟）（右）处理的 HT-1080 细胞进行共聚焦免疫荧光分析单克隆抗体（绿色）。肌动蛋白丝用 DY-554 鬼笔环肽（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（荧光 DNA 染料）。 流式细胞分析使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb（蓝色）与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（红色）比较的 HeLa 细胞。染色质免疫沉淀使用交联使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，从经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 处理的 HeLa 细胞中提取染色质。DNA 文库是使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备。该图显示了通过 IL-8 的结合，IL-8 是 NFκB 的已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。For 额外的 ChIP-seq 轨道，请下载产品数据表。 染色质免疫沉淀IP 套件（磁珠）#9005。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 4 号染色体（上图）的结合，包括 IL-8（下图），一种已知的 NFκB 靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）。 染色质免疫沉淀使用 SimpleChIP® Enzymatic 使用 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 处理的 HeLa 细胞的交联染色质进行 s染色质 IP 试剂盒（磁珠）#9003。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。 CUT&RUN。使用 Illumina® 的 DNA 文库制备试剂盒 (ChIP-seq，剪切和运行）#56795。该图显示了跨 LAMC2 的结合，LAMC2 是 NF-κB p65 的已知靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。 CUT&RUN。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。这些图显示了跨 1 号染色体（上图）的结合，包括 LAMC2（下图），一种已知的 NF-κB p65 靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。 CUT&RUN 是对经 hTNF-α #8902 (30 ng/ml，1 小时）和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。使用人 LAMC2 上游引物和人 ITM2A 上游引物通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。购买#8242Cat。 #SizeQty.Price8242T20µl$1478242S100µl$352

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抗体保证FAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica - EnglishEurope - ChineseEurope - DutchEurope - EnglishEurope - FrenchEurope - GermanEurope - ItalianEurope - KoreanEurope - PortugueseEurope - SpanishEurope - SwedishCertificate of AnalysisSupporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYH M R Hm Mk DgSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)65Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-免疫沉淀IHC-I免疫组化ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品偶联物

产品信息

产品使用信息为了获得最佳的 ChIP 和 ChIP-seq 结果，使用 5 μl 抗体和 10 μg 染色质（约4 x 106 个单元）每个 IP。该抗体已使用 SimpleChIP® En 进行验证酶染色质 IP 试剂盒。使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 确定 CUT&RUN 稀释度。ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000Simple Western™1:10 - 1:50Immunoprecipitation1:100Immunohistochemistry (Paraffin)1:400 - 1:1600Immunofluorescence (Immunocytochemistry)1:400 - 1:1600F低细胞计数（固定/透化)1:400 - 1:1600Chromatin IP1:100Chromatin IP-seq1:100CUT&RUN1:100StorageSupplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% 甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠.储存于 –20°C。不要等分抗体。有关本产品的无载体（BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #69994。方案选择您的方案Western Blotting免疫沉淀免疫组织化学（石蜡）免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）染色质 IPChromatin IP-seqCUT&RUNPRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 中孵育20 4°C 轻轻摇动过夜。

注意：推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。用 dH2O.10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液稀释至 1X：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O，混合。10X Tris-Glycine Transfer B缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O 中，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol fo 蛋白印迹r 样品制备。通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。保持在冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同大小的成员ranes，相应地调整体积。

I。膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂），在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物在室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：清洗膜结合的 HRP（抗体结合物）t在 TBST 中 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在利用蛋白 A 琼脂糖珠对天然蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，添加 1 ml将细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色装载包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。蛋白 A 琼脂糖珠：(#9863)。10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：（# 9802) 要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O 中，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 添加到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声三吨每次 5 秒。4°C，14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预清除（可选）涡旋混合珠子。将 10–30 µl 50% 蛋白 A 琼脂糖珠浆添加到 200 µl 细胞裂解物中，浓度为 1 mg/ml。在 4°C 下旋转孵育 30–60 分钟。 4°C 微量离心 10 分钟。将上清液转移到新试管中。继续进行下面的免疫沉淀。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。对兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，对兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，对小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）以 1 mg/ml 的浓度添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。添加蛋白 A 琼脂糖（10–30 µl 50% 珠浆）。在 4°C 下旋转孵育 1-3 小时。在 4°C 下微量离心 30 秒。用 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次清洗之间保持在冰上。通过蛋白质免疫印迹或激酶活性（D 部分）进行样品分析。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀。涡旋，然后以 14,000 x g 微量离心 30 秒。将样品加热至 95–100°C 2-5 分钟，并以 14,000 x g 离心 1 分钟。将样品 (15–30 µl) 加载到 4–20% 凝胶上进行 SDS-PAGE。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：当使用兔体内产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（轻链特异性）(D4W3E) mAb (#45262)​​ 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）作为二抗，以最大限度地减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量在 25 kDa 范围内的蛋白质，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以最大限度地减少变性小鼠轻链产生的干扰。

当使用小鼠产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (L右链特异性）(D3V2A) 单克隆抗体（HRP 偶联物）(#58802) 作为二抗，以最大限度地减少变性小鼠重链产生的干扰。

通过激酶分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一个管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 上 (4–20%)。

2008 年 12 月发布

2021 年 10 月修订

方案 ID：409

免疫组织化学（石蜡）A.溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

二甲苯。乙醇，无水变性，组织学级（100% 和 95%）。去离子水 (dH2O).苏木精（可选）。洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：要制备 1L 1X TBST，将 100ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 添加到 900 ml dH20 中，混合。SignalStain® Antibody稀释剂 (#8112).1X 柠檬酸盐暴露溶液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐暴露溶液，请用 225 mL dH2O 稀释 25 mlof SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)。3% 过氧化氢：制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 mldH2O。封闭溶液：TBST/5% 正常山羊血清或 1X 无动物封闭溶液。TBST/5% 正常山羊血清：至 5 ml 1X TBST，添加 250 µl 正常山羊血清(#5425).1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH2O 添加 1 ml Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。检测系统：SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔 #8114）。底物：SignalStain® DAB 底物试剂盒 (#8059)。苏木精：苏木精 (#14166)。封固剂：SignalStain® 封固剂 (#14177)。B.脱石蜡/再水化

注意：不要在此过程中随时让载玻片变干。

切片脱蜡/水合：切片在二甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。切片在 100% 乙醇中洗涤两次，每次 10 分钟。切片分两次孵育用 95% 乙醇洗涤，每次 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。抗原去掩蔽

对于柠檬酸盐：在微波中加热载玻片，浸没在 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液中，直到开始沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下 10 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。

D.染色 在 dH2O 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在 3% 过氧化氢中孵育切片 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。用 100–400 µl 封闭每个切片1 小时的首​​选封闭溶液在室温下处理 1 小时。去除封闭溶液并向每个切片添加 100–400 µl 用 SignalStain® AntibodyDiluent (#8112) 稀释的一抗。 4°C孵育过夜.将 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）平衡至室温。去除抗体溶液并用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。用 1–3 滴 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔）覆盖切片#8114）根据需要。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB 显色剂浓缩液加入 1 ml SignalStain® DABDiluent 中，并在使用前充分混合。应用 100–将 400 µl SignalStain® DAB 加入每个切片并密切监测。 1–10 分钟通常可提供可接受的染色强度。将载玻片浸入 dH2O 中。如果需要，用苏木精 (#14166) 对切片进行复染。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。脱水切片：将切片在 95% 乙醇中孵育两次每次 10 秒。在 100% 乙醇中重复两次，每次 10 秒。在二甲苯中重复两次，每次 10 秒。安装切片机智h 盖玻片和封固剂 (#14177)。检测试剂/底物相容性推荐检测试剂 SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔）#8114SignalStain® Boost IHC 检测试剂（AP，兔）#18653兼容的 CHROMOGENalStain® DAB 底物试剂盒 #8059S ignalStain® 充满活力红色碱性磷酸酶底物试剂盒 #76713SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phoxidase Substrate Kit #12824SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644

注意：检测试剂的使用其他可能需要进一步优化一抗以解决检测试剂的不同敏感性。

2010 年 2 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id: 283

免疫荧光（免疫细胞化学）A.溶液和试剂

实现更高质量的免疫荧光使用我们的 #12727 免疫荧光应用解决方案套件中高效且具有成本效益的预制试剂生成图像

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 水或同等等级的水制备溶液。

20X磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混合。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。封闭缓冲液（1X PBS / 5 % 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混匀后加入 0.1 g BSA (9998)，混匀。

推荐荧光染料标记的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 488 偶联物）#4412抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 555 偶联物）# 4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) # 4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。

注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：所有后续孵育都应在室温下进行，除非在 a 中另有说明潮湿的不透光盒或带盖的培养皿/板，以防止干燥和荧光染料褪色。

在封闭缓冲液中封闭样本 60 分钟。封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭溶液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。在抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中孵育标本，室温避光孵育 1-2 小时。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。盖玻片使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。为获得最佳效果，让封固剂在室温下固化过夜。对于长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2006 年 11 月发布

2013 年 11 月修订

方案 ID： 24

流式细胞术，兔抗体 A 的甲醇透化协议。解决方案和试剂

本协议所需的所有试剂都可以在我们的细胞内流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593 中有效地一起购买，或者使用下面列出的目录号单独购买。

注意：准备反渗透去离子溶液（ RODI) 或同等级别的水。

1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇（# 47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷藏抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) ( #9998) 在 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当您的实验中包含荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料推荐协议的产品页面。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化之前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞，同时轻轻涡旋，使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色

注：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

将所需数量的细胞等分到试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

6 月修订2020

方案 ID：404

染色质 IP

特定产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需试剂

试剂包括：

甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP 缓冲液 (10X) #7008ChIP 洗脱缓冲液 (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP 级蛋白 G 磁珠 #9006DNA 结合缓冲液 #10007DNA 洗涤缓冲液（使用前加入 4 倍体积的乙醇） #10008DNA 洗脱缓冲液 #10009DNA 纯化柱和收集管 #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012RNAse A（10 mg/ml ) #7013Micrococcal Nuclease #10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal Rabbit IgG # 2729DTT（二硫苏糖醇）#7016

不包括试剂

磁力分离架#7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（Sterile) #9872Nuclease-free Water #12931Ethanol (96-100%)Formaldehyde (37% Stock)SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989！这！表示协议中关于基于免疫沉淀准备 (IP 准备) 数量的体积变化的重要步骤。一份 IP 制备定义为 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 或分解组织。！！这 !!表示在继续之前稀释缓冲区的重要步骤。安全停止如果需要停止，这是协议中的安全停止点。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻并储存在 -80°C 下供以后处理。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织可能需要每次免疫沉淀超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。如果需要，应处理另外五个染色质样品以优化染色质消化（附录 B）。

开始前：

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加.

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的提丝UE样本。对每个要执行的 IP 使用 25 mg 的组织（一个实验至少需要 75 mg 的组织，以包括阳性和阴性对照）。将组织样本放入 60 mm 或 100 mm 的培养皿中，并使用干净的细碎手术刀或刀片。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸来停止交联，并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中，在 4°C 下以 500 x g 离心组织 5 分钟.去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 洗涤一次。在 4°C 的台式离心机中以 500 x g 重复离心 5 分钟。去除上清液并重悬每 25 毫克组织在 1 毫升 PBS + PIC 中找到组织并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。 （安全停止）或者，样品可以在分解前在 -80°C 下储存长达 3 个月。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均质悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 到 5，直到所有组织都磨成角状均质悬浮液。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。在台式离心机中 4°C 下以 2,000 x g 离心细胞 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续进行细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。 C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续进行细胞核制备和染色质消化（第三部分）。细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞（至少需要 12 X 106 个细胞以包括阳性和阴性对照）。对于 HeLa 细胞，一个 IP 相当于 h15 cm 培养皿的一半包含在 20 ml 生长培养基中 90% 汇合的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。由于每种细胞类型都不同，我们建议在实验中加入一皿额外的细胞，用于使用血细胞计数器或细胞计数器测定细胞数量。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应增加根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）的数量按比例分配。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）进行处理并置于冰上。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 40 ml PBS待处理并置于冰上。每 15 厘米培养皿准备 540 微升 37% 甲醛（或 20 毫升悬液n 细胞) 进行处理并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。对于悬浮细胞，向悬浮在 20 ml 培养基中的细胞中加入 540 µl 37% 甲醛（为实现悬浮细胞的最佳固定，固定时细胞密度应低于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。删除 s上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰冷的PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。 （安全停止）或者，样品可以在 -80°C 下储存长达 3 个月。III。细胞核制备和染色质消化开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加。

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT crystals 完全在溶液中。

(!!)重要提示：在溶液中后，将 1M DTT 储存在 -20°C 下。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全在溶液中。准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于冰上。重悬每次 IP 制备时，将细胞置于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在 100 µ 中重悬沉淀l 1X Buffer B +DTT 每个 IP 准备。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。每次免疫沉淀制备加入 10 µl 0.5 M EDTA #7011 停止消化并将试管置于冰上 1-2 分钟。在微量离心机中 4°C 下以 16,000 x g 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。在 100 µl 1X ChIP 中重悬细胞核每个 IP 制备的缓冲液 + PIC 并在冰上孵育 10 分钟。每个 1.5 ml 微量离心管用多达 500 µl 的裂解物进行声波处理，并多次脉冲以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。 （安全停止）这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下储存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物用于染色质消化和 C 分析浓度（第四节）。该 50 µl 样品可在 -20°C 下储存过夜。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA列如第 VII 节所述。 （安全停止）DNA 可在 -20°C 下保存长达 6 个月。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品，并在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上通过电泳确定 DNA 片段大小。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp（1 至 5 个核小体）的长度。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中，得到 50-f旧稀释液并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，将 100 µl 消化的染色质稀释在添加抗体之前加入 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

去除和温暖的 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制备物（来自第 III 部分的第 9 步）并置于冰上。准备低盐洗涤液：3 ml 1X ChIP Buffer （300 微升 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 毫升水）每次免疫沉淀。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl water) + 70 µl 5M NaCl #7010 每次免疫沉淀。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。每次免疫沉淀时，向制备好的 1X ChIP 缓冲液中添加相当于 100 µl（5 至 10 µg 染色质）的消化交联染色质制剂（来自第 III 部分的第 9 步）。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl sam取稀释的染色质并转移到微量离心管中。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参阅数据表或产品网页上列出的推荐稀释度，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算阴性对照的 IgG 抗体量 (µg)，以进行公平比较。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：大多数抗体来自 CellSignaling Technology 在每个 IP 样本 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。重复步骤 6 和 7 两次，总共 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将 t他管在磁力分离架上。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

取出并加热 2X ChIP 洗脱在 37°C 水浴中缓冲 #7009，并确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）用于每次免疫沉淀和 2% 输入样品。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中，并在室温下放置直至步骤 6。向每个 IP 样品添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。从中洗脱染色质抗体/蛋白 G 磁珠在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）30 分钟。恒温器 w最适合这一步。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。通过将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到向所有试管（包括来自步骤 1 的 2% 输入样品）添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存最多 4 天。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始前 (!!) 使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA puri 之前执行一次fications. 从第 V 节中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。向每个 DNA 样本中添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋。每 1 体积样本应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱n. 将 50 µl DNA 洗脱缓冲液 #10009 添加到每个离心柱中，并放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 18,000 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可以储存在 -20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°C 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR） 80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法根据要分析的样品数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP 混合物 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序： A。初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。分机 72&d例如；C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 分钟 从每个 PCR 产物中取出 10 微升，用带有 100 bp DNA 标记的 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。 A向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。 （安全停止）如有必要，用铝箔盖板避光，并在 4°C 下储存最多 4 小时或 -20°C 过夜，直到机器准备好使用。1 次 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR 反应的阈值循环

IX. NG 测序文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#47538。

建议：

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng 的 ChIP 富集 DNA 并使用 10 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰，或输入样本，从 50 ng ChIP 富集 DNA 开始，然后用 6 个循环扩增接头连接的 DNAPCR 的 es。对于所有目标类型的 ChIP 富集 DNA 库构建，在不选择大小的情况下执行适配器连接 DNA 的清理。DNA 库构建后，使用安捷伦检查 DNA 库是否存在适配器二聚体（~140 bp）高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦科技，目录号 G2938-90322），或通过琼脂糖凝胶电泳在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上使用 50-100 ng DNA。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

收获杂交时-来自组织样本的连锁染色质，染色质 c 的产量组织类型之间存在显着差异。右表提供了与 4 x 106 HeLa 细胞相比，25 毫克组织的染色质预期产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 解聚的组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器解聚的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，某些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

Tissue/CellTotal Chromatin 产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg 每 25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg 每 25 mg 组织 100-150 µg/ml 肾脏 8-10 µg 每 25 mg 组织 80-100 µg/ml 脑 2-5 µg每 25 mg 组织 20-50 µg/mlHeart 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/mlHeLa 每 4 x 106 个细胞 10-15 µg 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

最佳将交联染色质 DNA 消化至 150-900 个碱基对长度的条件在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织数量或细胞数量的比例。以下是确定最佳条件的方案特定组织或细胞类型的消化条件。

从 125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 次 IP 制备）制备交联细胞核，如第 I、II 和 III 部分所述。第 III 部分的第 2 步并按如下所述进行。转移 100 µl 细胞核制备物放入 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管中并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）中。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 µl， 2.5 µl、5 µl、7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，通过倒置试管多次混合并在 37°C 下频繁混合孵育 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 停止每次消化并放置冰上的管。在微量离心机中 4°C 下以 16,000 x g 离心 1 分钟沉淀细胞核，并去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬细胞核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。 HeLa 细胞核在 3 组 20-s 后完全裂解ec 脉冲使用 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声仪设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每 50 µl 样品中加入 100 µl无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中加入 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并孵育样品在 65°C 下处理 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在所需的 150-900 范围内碱基对（1 至 5 个核小体）。产生的稀释微球菌核酸酶的体积es 使用此优化方案所需的 DNA 片段大小相当于微球菌核酸酶原液体积的 10 倍，应将其添加到一种免疫沉淀制备物（25 mg 分解的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）中以产生所需的大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此实验方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则在第 III 部分的染色质消化过程中，应将 0.5 µl 微球菌核酸酶原液添加到一次免疫沉淀制备中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质中的细胞不足在消化或消化后细胞核没有完全裂解。

如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

对单独的细胞板进行计数在交联之前确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以了解染色质的优化n 消化。

3．染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。

在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。丁设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。

6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者, 添加到 IP 反应中的抗体过多。

添加到 PCR 反应中的 DNA 过多或扩增循环过多。

添加不超过 15 µg 染色质和 10 µl每个 IP 反应的组蛋白 H3 抗体。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；然而，确切的数量在很大程度上取决于个人抗body.

增加添加到 IP 中的抗体量。寻找替代抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：82

染色质 IP

特定于产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）#9005。

所需试剂

包括的试剂：

Glycine Solution (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP Buffer (10X) #7008ChIP Elution Buffer (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）# 10008DNA洗脱缓冲＃10009DNA纯化列＃10010普罗维斯抑制剂鸡尾酒（200x）＃7012RNase A（10 mg/ml）＃7013micrococcal核酸酶（2000凝胶单位/µL） 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal Rabbit IgG #2729DTT（二硫苏糖醇）#7016

不包括试剂：

磁性分离架 #7017 / 14654磷酸盐缓冲盐水 (PBS-1X) pH7.2（无菌）#9872无核酸酶水 #12931乙醇（96-100 %）甲醛（37% 原液）Taq DNA 聚合酶 NTP MixI。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻以备后用。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。

在 st 之前艺术：取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。每个要执行的 IP 使用 25 毫克的组织。将组织样本放入 60 毫米或 100 毫米的盘子中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。停止交叉- 通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸进行连接，并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中在 4°C 下以 1,500 rpm 的速度离心组织 5 分钟。去除上清液并用 1 ml PBS + PIC 每 25 mg 组织。在台式离心机中在 4°C 下以 1,500 rpm 重复离心 5 分钟。去除上清液并将组织重悬于每 25 mg 组织 1 ml PBS + PIC 中并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。 Tr将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均匀的悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中于 4°C 下以 1,500 rpm 的速度离心细胞 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中 4°C 下以 1,500 rpm 离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第三部分）.II.细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞。对于 HeLa 细胞，这相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中 90% 汇合的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。在实验中加入一盘额外的细胞，用于使用血细胞计数器测定细胞数量。

开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 和 10X 甘氨酸溶液 #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 待处理的培养皿并置于冰上。每 15 cm 培养皿准备 40 ml PBS 待处理并置于冰上。准备 540 µl 37%每 15 cm 培养皿中的甲醛要处理并保持在室温下。使用未过去的新鲜甲醛制造商的有效期。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 1,500 rpm 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰-冷 PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。刮细胞ls 进入冷缓冲区。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的转速离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。细胞核制备和染色质消化

一次免疫沉淀制备（IP 制备）定义为 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞。

开始前取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。

准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

重要提示：一旦溶解，将 1M DTT 储存在 -20°C。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全溶解.准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每个 IP 制备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每个IP 准备并置于冰上。每次 IP 准备时，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 3,000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。量将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的数量可能需要针对个体组织和细胞系凭经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化并将试管置于冰上。在 4°C 下在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。根据 IP 制备在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，并在冰上孵育 10 分钟。每个 1.5 ml 微量离心管最多可处理 500 µl 裂解物，并使用多个脉冲来破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定名词使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下保存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物，用于分析染色质消化和浓度（第 IV 部分）。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。Vortex 在 65°C 下混合和孵育样品 2 小时。按照第 VII 节所述使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品并通过电泳在 1%带有 100 bp DNA 标记的琼脂糖凝胶。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致信号减弱最终在 PCR 定量中。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制剂（来自第 III 部分中的步骤 9）并置于冰上。准备低盐洗涤液：每次免疫沉淀 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。向准备好的 1X ChIP 缓冲液中加入相当于 100 &微升（5 至 10 µg 染色质）消化的交联染色质制剂（来自第 III 部分中的步骤 9）每次免疫沉淀。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。孵化器将 IP 样品在 4°C 下旋转 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个 IP 样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。重复步骤 6 和 7 两次，总共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入微珠中，并在 4°C 下孵育 5 次min 旋转。通过将管置于磁力分离架中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始前取出 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 并在 37°C 水浴中加热，确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。为每次免疫沉淀和 2% 输入样品准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中并备用在室温下进行第 6 步。向每个 IP 样品中添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）从抗体/蛋白 G 磁珠中洗脱染色质 30 分钟。恒温器最适合此步骤。选择ly，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。将管放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 至 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到向所有试管（包括来自步骤 1 的 2% 输入样品）添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。或者，样品可以储存在 -20°C。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始之前在使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。为每个样品取出一个 DNA 纯化收集管 #10010来自第 V 节的 DNA 样本。将 750 µl DNA Binding Buffer #10007 添加到每个 DNA 样本并短暂涡旋。每 1 体积样本应使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样本 450 µl 转移到 DNA收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。向每个离心柱中添加 50 µl DNA 洗脱缓冲液 #10009，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。样品可以储存在-20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（对于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法根据要分析的样品数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP 混合物 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序： A。初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最后延伸 72°C 5 分钟从每个 PCR 产物中取出 10 微升，用带有 100 bp DNA 标记的 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。ReagentVolume for1 PCR Reaction (18 µl)Nuclease-free H2O 6 µl5 µM RPL30 Primers 2 µlSYBR-Green Reaction Mix 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG 测序文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，使用 DNA 文库制备与您的下游测序平台兼容的方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物） (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。

建议：

用于转录因子或辅助因子ChIP-seq，使用至少 5 ng 富含 ChIP 的 DNA 并通过 10 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰或输入样本，从 50 ng 富含 ChIP 的 DNA 和扩增开始6 个 PCR 循环的适配器连接 DNA。对于所有目标类型的 ChIP 富集 DNA 文库构建，在不选择大小的情况下执行适配器连接 DNA 的清理。DNA 库构建后，检查 DNA 库是否存在适配器二聚体(~140 bp) 使用安捷伦高灵敏度DNA 试剂盒（安捷伦科技，目录号 G2938-90322），或通过琼脂糖凝胶电泳在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上使用 50-100 ng DNA。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

收获杂交时来自组织样本的连锁染色质，染色质的产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。右表提供了 25 mg 组织与 4 x 106 HeLa 细胞相比的预期染色质产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每个组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器进行解聚产生了相似数量的染色质。但是，使用 Medimachine 解聚的组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器解聚的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg/25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg/25 mg 组织 100- 150 µg/ml 肾脏 每 25 mg 组织 8-10 µg 80-100 µg/ml 大脑 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/ml 心脏 2-5 µg 每 25 mg 组织 20-50 µg/mlHeLa 每 4 x 106 个细胞 10-15 µg 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

消化交联染色质 DNA 的最佳条件150-900 个碱基对的长度在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织数量或细胞数量的比例。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。按照第 I、II 和 III 部分所述，从 125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 个 IP 制备物）中制备交联细胞核。在第 III 部分的第 2 步后停止，然后按如下所述继续操作。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管中并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）中。将 5 个管中的每一个第 2 步，添加 0 µl、2.5 µl、5 µl、7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，通过倒置试管数次混合并在 37°C 下频繁混合孵育 20 分钟。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上停止每次消化。通过离心沉淀细胞核在 4°C 下以 13,000 rpm 的速度在微量离心机中离心 1 分钟并去除上清液。在 200 µl 的 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。按百分比澄清裂解物在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每份 50 µl 样品中加入 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2微升 RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 微升蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。取出 20 微升每个样品并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在 150-900 个碱基对（1 至 5 个核小体）的所需范围内。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶体积相当于应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解组织细胞或 4 X 106 组织培养物）中的微球菌核酸酶原液体积的 10 倍细胞）以产生所需大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则应在第 III 节中的染色质消化过程中将 0.5 µl 储备微球菌核酸酶添加到一个 IHC 制备物中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

计算一个单独的 p交联前细胞的晚期，以确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核，以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量过程中减弱信号，尤其是对于大于长度为 150 bp。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。

在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．没有产品在阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。

6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。

PCR 反应中添加了过多的 DNA 或扩增循环过多。

添加的染色质不超过 15 µg 和 10微升组蛋白 H3 抗体用于每个 IP 反应。减少正常 r 的量每次免疫沉淀 1 µl 兔 IgG。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。寻找替代抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：1184

CUT&RUN 方案！这 ！标志着协议中的重要一步关于基于正在执行的 CUT&RUN 反应数量的体积变化。!!这个!!表示在继续之前稀释缓冲液的重要步骤。安全停止如果需要停止，这是协议中的安全停止点。细胞和组织制备

对于大多数细胞类型，活细胞可用于 CUT&RUN 检测以产生组蛋白、转录因子和辅因子的稳健富集。对于某些脆弱或对伴刀豆球蛋白 A 敏感的细胞类型，一种轻型细胞固定有助于保存细胞并使其保持完整。此外，如果使用新鲜细胞未观察到强信号，固定可能有助于促进低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子的富集。请注意，细胞的过度固定会抑制 CUT&RUN 分析。

我们的 CUT&RUN 分析适用于范围广泛的细胞或组织输入。如方案中所定义，一次 CUT&RUN 反应可包含 5,000 至 250,000 个细胞或 1 至5 毫克组织。整个协议中使用的缓冲液体积不需要根据每次反应的细胞或组织数量进行调整，只要它在此范围内即可。当有指示时，缓冲液体积确实需要根据正在执行的反应数量按比例增加。如果可能，我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果细胞数量有限，我们建议每次反应至少使用 5,000 至 10,000 个细胞进行组蛋白修饰，每次反应至少使用 10,000 至 20,000 个细胞进行转录因子或辅助因子。

注意：建议用于细胞透化的毛地黄皂苷的量是过量并且应该足以透化大多数细胞系和组织类型。然而，并非所有细胞系和组织都对毛地黄皂苷表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织不适用于推荐的毛地黄皂苷浓度，您可以按照附录 A 中提供的方案优化条件。onin 处理应导致 >90% 的细胞群透化。

A.开始前的活细胞准备：

!所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每个细胞系 2 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X Wash Buffer #31415 + 25 µl 100X Spermidine #27287 + 12.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以最大程度地减少对细胞的压力。

注意：应在室温下连续执行活细胞（无固定）制备步骤，以最大程度地减少对细胞的压力。为尽量减少 DNA 碎片，避免样品剧烈涡旋和空化在重悬期间。为 CUT&RUN 制备活细胞时，我们建议在制备细胞之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠（第 II 部分，步骤 1 至 5），以尽量减少细胞在珠制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

在室温下收获新鲜的细胞培养物以尽量减少对细胞的压力。为每个反应收集 5,000 到 100,000 个细胞，并为输入样本额外收集 5,000 到 100,000 个细胞。确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

注意：对于贴壁细胞，首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，因为这会对细胞造成压力甚至裂解。应使用 hemoc 对细胞进行计数ytometer 或其他细胞计数器，以确保正确数量的细胞被用于实验。

在室温下以 600 x g 离心细胞悬液 3 分钟并去除液体。

注意：使用低细胞数（<100,000 个总细胞）的挑战在于离心后的细胞沉淀并不总是可见肉眼观察，因此在洗涤步骤中很容易丢失细胞。因此，当处理低细胞数时，我们建议跳过下面的第 3 至 5 步洗涤步骤。 Concanavalin A 珠子与细胞的结合在结合反应中可以耐受 40% 的细胞培养基。因此，在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每个反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在第 6 步中，向细胞悬液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

在 1 ml 的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀在 r通过轻轻上下吹打至室温。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟并去除液体。通过重复步骤 3 和 4 一次来第二次清洗细胞沉淀。对于每个反应或输入样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）并通过轻轻上下吹打重悬细胞沉淀。将 100 µl 细胞转移到新试管中并在 4°C 下储存直至第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样品将在稍后的实验方案中在 55°C 下孵育，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少孵育期间的蒸发。

立即进行第 II.B 部分。固定细胞制备

注意：固定细胞制备需要以下试剂且不包含在该试剂盒中：37% 甲醛或 16% 甲醛无甲醇 #12606、Glycine Solution (10X) #7005 和 10% SDS解决方案 #20533。

开始之前：

！所有缓冲液体积应按比例增加关于正在执行的 CUT&RUN 反应的数量。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每个细胞系 2 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X Wash Buffer #31415 + 25 µl 100X Spermidine #27287 + 12.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以最大程度地减少对细胞的压力。每 1 毫升待处理的细胞悬液准备 2.7 微升 37% 甲醛或 6.25 微升 16% 甲醛无甲醇 #12606 并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。为每个抗体/MNase 反应收集 5,000 至 100,000 个细胞，并为输入样本额外收集 5,000 至 100,000 个细胞。一定要包括对 po 的反应阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362。

注意：对于贴壁细胞系，首先是细胞需要使用胰蛋白酶从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的培养基中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，因为这会对细胞产生压力，甚至会裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，以确保实验中使用的细胞数量正确。

每 1 ml 添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 甲醛无甲醇 #12606细胞悬浮液达到最终浓度为 0.1% 的甲醛。旋转试管以混合并在室温下孵育 2 分钟。通过每 1 ml 固定细胞悬液添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转管子以混合并在室温下孵育 5 分钟。在 3 下离心细胞悬液 3 分钟，4°C 下 000 x g 并去除液体。立即进行第 5 步。（安全停止）或者，固定的细胞沉淀在使用前可在 -80°C 下保存长达 6 个月。

注意：处理低细胞数（<100,000 个细胞总数）的挑战是离心细胞沉淀并不总是肉眼可见，因此在洗涤步骤中很容易丢失细胞。在这种情况下，我们不建议冷冻细胞沉淀。此外，在处理这些低细胞数时，我们建议跳过下面的第 5 至 7 步洗涤步骤。 Concanavalin A 珠子与细胞的结合在结合反应中可以耐受 40% 的细胞培养基。因此，在第 4 步中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每个反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在第 8 步中，向细胞悬液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

重悬细胞沉淀 in 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），轻轻上下吹打。在 4°C 下以 3,000 x g 离心 3 分钟并去除液体。通过重复步骤 5 和 6 来第二次洗涤细胞沉淀时间。对于每个反应或输入样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）并通过轻轻上下吹打重悬细胞沉淀。将 100 µl 细胞转移到新管中并在 4°C 下储存直至第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样本稍后将在实验方案中在 55°C 下孵育，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少孵育期间的蒸发。立即进入第 II.C 部分。组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 轻微固定的组织（0.1% 甲醛，2 分钟）可以产生组蛋白、转录因子和辅助因子的稳健富集。组蛋白修饰的富集不需要甲醛固定。然而，许多转录因子nd 辅因子确实需要对组织进行光固定以获得最佳结果。一些低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子可能需要中度固定（0.1% 甲醛 10 分钟）以获得最佳结果。此外，在使用困难的组织类型（如纤维组织）时，介质固定可以改善结果。请注意，过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。固定的组织样本在使用前可在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。

注意：为 CUT&RUN 准备新鲜组织（未固定）时，我们建议在准备组织之前准备 Concanavalin A Beads（第 II 部分，步骤 1 至 5），以最大程度地减少细胞在准备过程中停留的时间。激活的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

注意：以下试剂是固定组织制备所必需的并且不包含在该试剂盒中：37% 甲醛或 16% 甲醛无甲醇 #12606 , 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872、甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。

开始之前：

！所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每种组织类型 3 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 3.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 350 µl 10X Wash Buffer #31415 + 35 µl 100X Spermidine #27287 + 17.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 3097.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以尽量减少对细胞的压力。如果需要组织固定，请准备以下缓冲液：通过添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 甲醛无甲醇，为每种组织类型准备 1 ml 固定缓冲液 # 12606 和 5 µl 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC)#7012 加入 1 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872 中。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。为每种组织类型准备 1 ml PBS #9872 + 5 µl Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 并置于冰上。准备 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005每 1 ml 固定缓冲液。为每个抗体/MNase 反应称量 1 mg 新鲜组织，并为输入样品称量额外的 1 mg 组织。确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

注意：对于某些转录因子或辅助因子，或对于纤维组织等困难组织类型，每次反应最多可使用 5 mg 组织，而无需按比例增加试剂。

将组织样本放入培养皿中，并使用干净的手术刀或剃刀切碎刀刃。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。

注意：我们建议对组织进行光固定，因为这种条件最适合大多数组织类型和蛋白质靶标。但是，如果需要新鲜组织，请跳过第 3 步到第 8 步并立即进行第 9 步。

立即将切碎的组织转移到 1 ml 固定液中并旋转管以混合。

注意：此体积的固定液足以处理高达 50 毫克的组织。如果处理 >50 mg，相应地在步骤 7 中放大固定溶液和 1X PBS + PIC 溶液。

在室温下孵育 2 分钟。

注意：对于困难的组织类型（如纤维组织）或低丰度和/或弱结合转录因子或辅助因子，将甲醛固定时间延长至 10 分钟可能会改善结果。

通过每 1 毫升固定缓冲液添加 100 微升甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转试管以混合并在室温下孵育 5 分钟。在 4°C 下以 2,000 x g 离心组织 5 分钟并去除液体。用重悬组织1 ml 1X PBS + PIC。在 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟，然后去除液体并继续执行步骤 9。（安全停止）或者，固定的组织沉淀可以在解聚之前储存在 -80°C至 6 个月。在 1 ml 的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬组织，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。通过 20-25 次冲程将组织块分解成单细胞悬浮液，直到观察不到组织块。转移细胞悬浮到 1.5 ml 试管中并在室温下以 3,000 x g 离心 3 分钟，从细胞中去除上清液。在 1 ml 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀。以 3,000 x g 离心细胞悬浮液 3 分钟室温并去除液体。重复步骤 12 和 13 一次，第二次洗涤细胞沉淀。对于每个反应，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），轻轻吸取重悬细胞沉淀，然后down. 将 100 µl 细胞转移到新管中，然后储存在 4°C 直到第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样本将在协议后面的 55°C 下孵育，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少孵育期间蒸发。

立即进行第 II.II 部分。 Concanavalin A Beads 和一抗的结合开始前：

!所有缓冲液体积应根据进行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

将伴刀豆蛋白 A Bead Activation Buffer 置于冰上。对于每个反应，准备 1 µl 100X Spermidine #27287 + 0.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2.5 µl Digitonin Solution #16359 + 96 µl Antibody Binding Buffer #15338 并置于冰上（每次反应 100 µl）。轻轻上下移液，小心重悬 Concanavalin A Magnetic Beads，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出管子。每次 CUT&RUN 反应将 10 µl 珠子悬浮液转移到新的 1.5 ml 微量离心管。

注意：避免涡旋振荡 Concanavalin A Magnetic Bead 悬浮液，因为反复涡旋可能会将 Concanavalin A 从磁珠上移开。

每 10 µl 磁珠添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。通过上下移液器轻轻混合珠子。将试管放在磁性架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。

注意：为避免珠子丢失，请使用移液管取出液体。不要使用真空抽吸。

从磁力架上取下试管。重复第 2 步和第 3 步，第二次清洗珠子。添加体积等于添加的珠子悬浮液初始体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer（每个样品 10 µl），并通过上下移液器重悬。

注意：如果按照活细胞和新鲜组织的建议，在细胞或组织制备之前准备好刀豆球蛋白 A 珠子，则可以将活化的珠子储存在冰上直至使用。

确保将刀豆球蛋白 A 珠子充分混合到溶液中化。在第 I-A 部分第 8 步、第 I-B 部分第 10 步或第 I-C 部分第 17 步中制备的洗涤细胞悬浮液中，每次反应添加 10 µl 活化珠悬浮液。通过上下移液器将样品充分混合。在室温下孵育 5 分钟。

注意：伴刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘在管壁上。珠子可以通过上下移液器重悬。

将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖中去除细胞：珠子悬浮液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出并丢弃液体。从支架上取下试管。每次反应添加 100 µl 抗体结合缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂甙）并置于冰上。将 100 µl 细胞：珠悬浮液等分到单独的 1.5 ml 管中用于每个反应并置于冰上。添加适量的抗体加入每个反应中，并通过上下吹打轻轻混合。

注意：所需的抗体量CUT&RUN 的 uired 各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751，向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体而不是无抗体对照，因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议尽可能使用输入样本与 qPCR 和 NG-seq 分析进行比较。

在 4°C 下孵育试管 2 小时。此步骤可延长至过夜。

注意：伴刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘附在管壁上。珠子可以通过上下移液器重悬。

III.开始前 pAG-MNase 酶的结合：

！所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

删除将洋地黄皂苷溶液 #16359 加热至 90-100°C 5 分钟，确保其完全解冻并溶解。立即将解冻的洋地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。

注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应储存在 -20°C 下。使用期间请置于冰上，当天结束后保存在 -20°C。

对于每个反应，准备 1.05 ml 洋地黄皂苷缓冲液（105 µl 10X Wash Buffer #31415 + 10.5 µl 100X Spermidine #27287 + 5.25 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 26.25 µl Digitonin Solution #16359 + 903 µl Nuclease-free Water #12931）。对于每个反应，通过添加 50 µl 洋地黄皂苷缓冲液（如上所述）和 1.5微升 pAG-MNase 酶到新管中。例如，对于 10 次反应，将 500 µl 洋地黄皂苷缓冲液转移到新试管中并添加 15 µl pAG-MNase 酶。轻轻上下移液混合并置于冰上。以 100 x g f 的速度将第 II 部分第 12 步中的样品短暂离心或 2 秒从管盖上取下细胞：珠子悬浮液。将管子放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。从磁力架上取下管子并添加 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）。通过轻轻上下吹打重悬珠子，确保收集到粘在管壁上的所有珠子。将管子放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。取出管子从磁力架。向每个试管中加入 50 µl pAG-MNase 预混液，并通过上下移液器轻轻混合样品。在 4°C 下孵育试管 1 小时。

注意：刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘在侧面管的。可以通过上下吹打来重新悬浮珠子。

立即进行第 IV.IV 节。 DNA 消化和扩散开始之前：

！所有缓冲液体积应根据 CUT&RUN 反应的数量按比例增加

取出 Digitonin Solution #16359 并将其加热至 90-100°C 5 分钟，确保其完全解冻并溶解。立即将解冻的洋地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。

注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应储存在 -20°C 下。使用期间请置于冰上，当天结束后保存在 -20°C。

对于每个反应，准备 2.15 ml 洋地黄皂苷缓冲液（215 µl 10X Wash Buffer #31415 + 21.5 µl 100X Spermidine #27287 + 10.75 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 53.75 µl Digitonin Solution #16359 + 1.849 ml Nuclease-free Water #12931）。将氯化钙置于冰上。如果从第 I 部分中的固定材料开始，确保 10% SDS Solution #20533 完全溶解在溶液中。将其加热至 37°C 有助于溶解 SDS 沉淀物。对于每个反应，准备 150 µl 1X 终止缓冲液（37.5 µl 4X 终止缓冲液 #48105 + 3.75 µl Digitonin Solution #16359 + 0.75 µl RNAse A #7013 +108 µl Nuclease-free Water #12931)。

可选：如果需要样品标准化，可以将样品标准化 Spike-In DNA 添加到 1X 终止缓冲液中（例如，参见第 VII 部分中的图 8）。对于 qPCR 分析，我们建议在每个反应中添加 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析，我们建议将 Sample Normalization Spike-In DNA 稀释 100 倍到 Nuclease-free Water #12931 中，然后向每个反应中添加 5 µl (50 pg) Spike-In DNA。当每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织时，这可确保标准化读数约为总测序读数的 0.5%。如果每个反应使用多于或少于 100,000 个细胞或 1 mg 组织，请按比例增加或减少样本标准化 Spike-In DNA 的体积，以将标准化读数调整到总读数的 0.5% 左右。

短暂离心样品来自第 III 部分，第 6 步，以 100 x g 离心 2 秒以从管盖上去除细胞：珠子悬浮液。将管子放在磁力分离架，直到溶液变清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。从磁力分离架上取出试管。加入 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）并轻轻上下移液以重悬珠子。重复步骤 2 和 3 一次。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟） )，然后取出液体。从磁力架上取出试管。向每个试管中加入 150 µl 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）并通过上下吹打混合。消化前将试管置于冰上 5 分钟以冷却。通过向每个试管中加入 3 µl 冷氯化钙激活 pAG-MNase管并通过上下吹打混合。将样品在 4°C 下孵育 30 分钟。

注意：消化应在 4°C 冷却块或冰箱中进行。冰的温度可低至 0°C，这会限制消化并降低信号。

添加 150 µl 1X 终止缓冲液（+ 洋地黄皂甙 + RNAseA + spike-in DNA [optional]) 添加到每个样品中，通过上下吹打混合。将试管在 37°C 下孵育 10 分钟，不要摇晃以将 DNA 片段释放到溶液中。在 4°C 下离心 2 分钟16,000x g 并将管子放在磁力架上，直到溶液澄清（30 秒至 2 分钟）。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心管中。这些是您的富集染色质样品。

注意：如果活细胞或新鲜组织（未固定）用于 CUT&RUN 检测，请跳过步骤 14-15 并立即进行步骤 16。

注意：固定样本稍后将在 65°C 下孵育，因此建议使用安全锁 2 ml 管以减少孵育期间的蒸发。

要逆转固定细胞或组织样本中的交联，允许将样品加热至室温，然后向每个样品中加入 3 µl 10% SDS Solution #20533（终浓度为 0.1%）和 2 µl 蛋白酶 K (20 mg/ml) #10012。

注意：SDS 可能会沉淀出来如果样品未预热至室温，则溶液的体积。

涡旋每个样品并在 65°C 下孵育至少 2 小时。这种孵育可以延长过夜。孵育后，以 10,000 x g 的速度快速旋转样品 1 秒，以收集管盖上的蒸发物。将样品平衡至室温，然后继续进行第 VI 部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存长达 1 周。但是，一定要在 DNA 纯化前将样品加热至室温（第 VI 部分）。 V. 输入样本的制备

输入 DNA 的片段化对于与下游 NG 测序的兼容性是必需的，但对于下游 qPCR 分析不是必需的。如果没有超声仪，我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析；但是，输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，因为未片段化的输入 DNA 太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果是索尼卡器不可用且需要下游 NG 测序分析，可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样本作为阴性对照，尽管这并不理想，因为正常的富含 IgG 的样本可能显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的输入 DNA 片段化方案可在 https://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion 获得。

！所有缓冲液体积应根据准备的输入样本数量按比例增加。

开始前：取出并加热 DNA Extraction Buffer #42015。确保它完全解冻。对于每个输入样本，准备 2 µl Proteinase K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013 + 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每个输入样本总共 200 µl）。加入 200 µl DNA Extraction Buffer （+ 蛋白酶 K + RNAse A）添加到来自第 I-A 步第 7 步、第 I-B 步第 9 步或第 I-C 步第 16 步的 100 µl 输入样本中。通过上下移液器吹打混合。将试管置于 55°C for 1 小时并摇动。将试管置于冰上 5 分钟以完全冷却样品。通过对输入样品进行超声处理来裂解细胞并破碎染色质。在两次脉冲之间将样品在冰上孵育 30 秒。

注意：超声处理条件可能需要根据附录 B 中的方案测试不同的超声功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定。最佳超声处理条件将产生染色质片段大小范围为 100-600 bp。使用设置为 6 的 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/超声仪和 1/8 英寸探针对 5 组 15 秒脉冲进行超声处理，充分破碎输入的染色质。

通过在 18,500 x g 下离心 10 分钟澄清裂解物4°C。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心管中。立即进行第 VI 节 DNA 纯化。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存长达 1 周。但是，一定要在 DNA p 之前将样品加热到室温净化程序（第 VI 节）.VI。 DNA 纯化

可以使用 DNA 离心柱从输入和富集的染色质样品中纯化 DNA，如第 VI - A 部分所述，或苯酚/氯仿提取，然后按照第 VI - B 部分所述进行乙醇沉淀。使用 DNA 离心柱纯化简单快速，可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段（图 7A，泳道 2）。苯酚/氯仿提取后进行乙醇沉淀更加困难，但可以更好地回收低于 35 bp 的 DNA 片段（图 7A，泳道 3）；然而，如图 7B 所示，CUT&RUN 分析中生成的大多数 DNA 片段都大于 35 bp。因此，DNA 离心柱提供了一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。

纯化的 DNA 可以在 NG-seq 分析之前使用基于 picogreen 的 DNA 定量分析进行定量.对于包含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应，预期的 DNA yi对于转录因子和辅因子，CUT&RUN 反应的场强范围为每次反应 0.5 至 10 ng，组蛋白修饰的每次反应范围为 1 至 20 ng。

图 7. 使用离心柱或苯酚/氯仿提取进行 DNA 纯化的比较如下通过乙醇沉淀。 (A) 使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（泳道 2）或苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀（泳道 3）纯化低范围 DNA 梯形混合物（泳道 1，未纯化）并通过电泳分离在 4% 琼脂糖凝胶上。如图所示，苯酚/氯仿随后进行乙醇沉淀可有效回收所有 DNA 片段大小，而 DNA 离心柱可回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 使用苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀从 CUT&RUNassay p 纯化 DNA使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) 兔单克隆抗体 #2569 进行。使用生物分析仪(Agilent Technologies)分析文库中DNA片段的大小。在构建过程中添加到库中的适配器和条形码序列占片段长度的 140 bp。因此，起始 35 bp 的 DNA 片段在文库制备后长度为 175 bp（图中用蓝色垂直线表示）。如图所示，不到 2% 的 CUT&RUN 富集 DNA 片段总数小于 175 bp（起始长度为 35 bp），表明 DNA 纯化离心柱足以捕获超过 98% 的 CUT&RUN DNA 片段总数。

A.使用离心柱纯化 DNA

注意：可以使用 DNA 纯化缓冲液和离心柱（ChIP、CUT&RUN）#14209（未包含在该试剂盒中）和以下修改后的方案从输入和富集的染色质样品中纯化 DNA。修改步骤 1 到 5 以反映添加 5 体积（1.5 毫升）DNA 结合的要求g 缓冲液至 300 µl 输入和富集染色质样品。

开始之前：！！使用前向 DNA 洗涤缓冲液中加入 24 ml 乙醇 (96-100%)。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。为每个富集染色质样品或要纯化的输入样品移除一个 DNA 纯化收集管。向每个输入和富集染色质样品添加 1.5 ml DNA 结合缓冲液并混合

注意：每 1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。

将步骤 1 中的每个样品 600 µl 转移到收集管中的 DNA 离心柱中。离心在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并丢弃液体。更换空收集管中的离心柱。重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品都通过离心柱旋转。更换空收集管中的离心柱。将 750 µl DNA 洗涤缓冲液添加到 t他在收集管中离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换空收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。在每个离心柱中加入 50 µl DNA 洗脱缓冲液并放入干净的 1.5 ml 管中。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可在 -20°C 下储存长达 6 个月。B.使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化 DNA

注意：苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀需要以下试剂，但不包含在该试剂盒中：苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) 、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 醋酸钠 (pH 5.2)、20mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。

将 300 µl 苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) 添加到每个输入和富集的染色质样品中，并通过涡旋 30 秒彻底混合。在微量离心机中以 16,000 x g 离心 5 分钟。小心地将顶部水层的大部分（避开中间相）转移到新管中。将 300 µl 氯仿/异戊醇 (24:1) 添加到水样中，涡旋 30 秒彻底混合。在 16,000 离心分离各层x g 在微量离心机中 5 分钟。小心地将顶部水层的大部分（避开中间相）转移到新管中。向每个水样中加入 25 µl 3M 醋酸钠 (pH 5.2)、1 µl 20mg/ml 糖原和 600 µl 100% 乙醇并混匀涡旋振荡 30 秒。在 -80°C 下孵育样品 1 小时或 -20°C 过夜以沉淀 DNA。在微量离心机中 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟沉淀 DNA。小心去除 su上清液并用 70% 乙醇洗涤沉淀物。在微量离心机中 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟沉淀 DNA。倒出上清液并风干沉淀物。在 50 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931 中重悬沉淀物.这是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可在 -20°C 下储存长达 6 个月。VII。通过 qPCR 对 DNA 进行定量建议：试剂盒中包含的样品标准化引物组特定于酿酒酵母 ACT1 基因，可用于量化来自样品标准化掺入酵母 DNA 的信号以进行样品标准化（可选）。包括额外的对照引物试剂盒中的特异性针对人或小鼠 RPL30 基因（#7014 或#7015），可用于三甲基组蛋白 H3 (Lys4)(C42D8)Rabbit mAb #9751 样品的实时定量 PCR 分析。如果用户对另一个物种进行 CUT&RUN，则用户需要设计合适的对照引物并确定最佳的 PCR 条件r那个物种。PCR引物的选择很关键。对于 CUT&RUN，PCR 扩增子的长度应约为 60 至 80 bp。引物的最佳解链温度应设计为 60°C 左右，GC 含量约为 50%。2 µl 纯化的 DNA 足以进行 qPCR 介导的靶基因定量组蛋白、转录因子和辅因子。建议使用热启动 Taq 聚合酶，以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。使用带过滤头的移液器吸头，以最大限度地降低污染风险。标记适当数量的 PCR 管或与要使用的 PCR 机器型号。 PCR 反应应包括阳性对照三甲基组蛋白 H3 Lys4 样品、阴性对照兔 IgG 样品、不含 DNA 的试管以控制 DNA 污染，以及连续稀释的输入 DNA（未稀释、1:5、1:25、 1:125) 创建标准曲线并确定扩增效率和量化每个免疫富集的 DNA 量样本。

注意：如果执行样本归一化，则仅使用样本归一化引物集分析 CUT&RUN 样本。输入 DNA 不包含归一化掺入 DNA。

将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为每个 PCR 反应设置 2-3 个重复。添加足够的试剂以弥补体积损失（1-2 次额外反应）。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)Nuclease-free H2O #129316 µl5 µM Primers2 µlSimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #8898910 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.Initial Denaturation95 °C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸 60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c 共 40 个循环。使用实时 PCR 机器提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，在e 可以使用百分比输入法和下面显示的方程式手动计算 IP 效率。使用此方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。输入百分比 = 100% x 2(C[T] 100%Input样本 - C[T] IP 样本）C[T] = CT = PCR 反应的平均阈值循环对于样本归一化，选择样本归一化引物集的 C[T] 值最低的样本作为所选样本（例如样本 1在下面的示例表中）并使用下面的等式计算其他样本的归一化因子。使用各自的归一化因子调整来自测试引物组的信号。qPCR 检测样本归一化示例（参见图 8）样本归一化引物集的 C[T] 值**归一化前 qPCR 信号的归一化因子（% 输入计算来自步骤 5)标准化后的信号样本 123.312(23.31-23.31)=1.0024.4%24.4%/1.00=24.4%样本 224.242(23.31-24.24)=0.5212.0%12.0%/0.52=23.1%样本 325.082(23.31-25.08)=0.296.28%6.28%/0.29=21.7%样本 426.302(23.31-26.30)=0.132.72%2.72%/0.13=20.9%

**归一化因子对于 qPCR = 2(C[T] 选定样本 - C[T] 其他样本)

图 8. 使用 DNA 中的尖峰对 CUT&RUN 信号进行标准化以进行 qPCR 分析。使用数量减少的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8)Rabbit mAb#9751（上图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（下图）进行 CUT&RUN .使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-ActinPromoter Primers #13653、SimpleChIP® Human β-Actin 3\' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® HumanMyoD1 Exon 1 Primers # 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量4490。每个样品中免疫沉淀的 DNA 量表示为 signal 相对于 100,000 个细胞的输入染色质总量。左侧面板中描述了非标准化的富集。样品归一化 Spike-In DNA 按起始细胞数的比例添加到每个反应中。基于每个样品中 DNA 刺突的 qPCR 信号的差异，CUT&RUN 信号被归一化为包含 100,000 个细胞的样品。归一化富集如右图所示。

VIII. NG-Sequencing Library Construction

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 NG-seq 兼容。对于下游 NG-seq DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538，遵循 CUT&RUN 协议DNA。

因为非常由于 CUT&RUN 中产生的低背景信号，每个样本 500 万个读数的测序深度通常足以用于组蛋白修饰和转录因子。如果每个样本的测序深度大于一千五百万，则读数的重复率会显着增加。如果每个样本的测序深度低于 200 万，则信噪比会降低。对于少于 20,000 个起始细胞数，通常会在 NGS 读数中获得较低的映射率或较高的重复率。如果发生这种情况，我们建议增加测序深度以获得足够数量的独特映射读数用于下游数据分析。在执行样本归一化时，将所有样本的 CUT&RUN 测序数据映射到测试参考基因组（例如人类）和样本归一化酿酒酵母基因组。选择具有最少独特酵母读数的样品作为所选样品（例如下表中的样品 1）并计算使用下面的等式其他样本的归一化因子。使用各自的归一化因子，减少与每个样本的测试参考基因组对齐的唯一读数的数量。使用缩小的数据集进行进一步的 NGS 分析。NGS 检测样本标准化的示例与酵母对齐的唯一读数的数量NGS 的标准化因子标准化前与测试参考基因组对齐的独特读数的数量标准化后与测试参考基因组对齐的独特读数的数量样品 1219 ,275219,275/219,275 = 1.005,077,7475,077,747 X 1.00 = 5,077,747样本 2411,915219,275/411,915 = 0.539,896,6719,896,671 X 0.53 = 5, 268,306样本 3816,235219,275/816,235 = 0.2717,842 ,77317,842,773 X 0.27 = 4,793,320样本 41,120,826219,275/1,120,826 = 0.2023,836,67923,836,679 X 0.20 = 4,663,339

NGS 的归一化因子 = 独特的数量酵母从选定样本中读取/独特的数量酵母从另一个样品中读取

附录 A：测定细胞对洋地黄皂苷的敏感性

在 CUT&RUN 方案中，向缓冲液中添加洋地黄皂苷有助于细胞膜的透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和细胞核。因此，在缓冲液中加入足量的洋地黄皂苷对于抗体和酶的成功结合以及目标基因组位点的消化至关重要。不同的细胞系对毛地黄皂苷细胞透化作用表现出不同的敏感性。虽然本协议中推荐的洋地黄皂苷的量应足以透化大多数细胞系或组织，但您可以使用此协议测试特定的细胞系或组织。我们发现添加过量的毛地黄皂苷对测定无害，因此无需绘制浓度曲线。相反，快速测试以确定推荐量的洋地黄皂苷是否适合您的细胞系。

开始前：取出洋地黄皂苷溶液并加热 #16359至 90-100°C 5 分钟。确保它完全解冻。立即将解冻的洋地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。

注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应储存在 -20°C 下。请在使用过程中保持在冰上，并在一天结束后储存在 -20°C。

对于每个细胞或组织样品，准备 100 µl 洗涤缓冲液（10 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 90 µl 无核酸酶水 #12931)。此测试无需添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。在 1.5 ml 管中，收集 10,000 - 100,000 个细胞。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解细胞（第 I-C 部分步骤 1-13）。如果您在 CUT&RUN 实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟并吸出液体。

注意：如果肉眼看不到细胞沉淀，我们建议在初始 cen 后尽可能多地去除细胞培养基而不干扰细胞沉淀在步骤 2 中分离细胞悬液，每次反应留下一些细胞培养基。然后在第 3 步中，向细胞悬浮液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液以达到 100 µl 的总体积。

在 100 µl 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀。向每个反应中添加 2.5 µl Digitonin Solution #16359 并孵育 10室温下 min。将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染色剂混合。使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞数和细胞总数。充分透化会导致 > 90% 的细胞被台盼蓝染色。如果台盼蓝染色的细胞少于 90%，则增加添加到洋地黄皂苷缓冲液中的 Digitonin Solution #16359 的量，并重复步骤 1-5 直到 > 90%细胞被透化和染色。在第 I - IV 部分中使用此量的 Digitonin Solution #16359。附录 B：输入样本的超声处理优化

建议对输入 DNA 样本进行超声处理发现是因为使用 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (<10 kb)。此外，片段化的基因组 DNA (<1kb) 可用作 NG-seq 分析中的阴性对照。应优化超声处理，使输入 DNA 的长度为 100-600 bp。

我们建议将输入样本用于 NG-seq，因为它提供了细胞基因组的方便和公正的表示。虽然 IgG 样本也可用作 NG-seq 的阴性对照，但由于非特异性结合，它可能会显示基因组特定区域的富集。未片段化的输入 DNA 可用于 qPCR 分析。然而，未片段化的 DNA 必须使用苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀进行纯化。

开始之前：

！所有缓冲液体积应根据准备的输入样本数量按比例增加。

取出 DNA Extraction Buffer #42015 并在室温下加热，确保其完全解冻并溶解.对于每个输入样品，准备 2.1 ml 1X 洗涤缓冲液（210 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 1.89 ml Nuclease-free Water #12931）并将其平衡至室温以尽量减少对细胞的压力。无需向该洗涤缓冲液中添加亚精胺或蛋白酶抑制剂混合物 #7012。对于每个输入样品，准备 2 µl Proteinase K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013 至 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每次输入 200 µl样本）。在 1.5 ml 试管中，针对每个测试的超声处理条件，收集与您在 CUT&RUN 实验中用于输入的相同数量的细胞（5,000 至 100,000 个细胞）。对于组织，从您在 CUT&RUN 实验（第 I-C 部分步骤 1-13）中输入的相同数量的组织中收集分解的细胞，用于测试的每个超声处理条件。如果您在实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟尿液并去除液体。

注意：如果在处理低细胞数（<100,000 个细胞）时肉眼看不到离心后的细胞沉淀，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中初始离心细胞悬浮液后，在不干扰细胞沉淀的情况下尽可能多地去除细胞培养基，并在每次反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 6 中，向细胞悬浮液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液，以达到每个待测超声处理条件 100 µl 的体积。

通过轻轻上下吹打，将细胞沉淀重悬于 1 ml 1X 洗涤缓冲液中。离心 3在室温下以 600 x g 的速度分钟并去除液体。通过重复步骤 3 和 4 一次来再次清洗细胞沉淀物。在每个待测试的超声处理条件下添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液，并通过轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物。对于每种超声处理条件，将 100 µl 细胞悬液等分到新试管中。

注意：样品将在第 9 步温度为 55°C，因此建议使用 safe-lock 1.5 ml 试管以减少孵育过程中的蒸发。

向每个样品中加入 200 µl DNA Extraction Buffer（+ Proteinase K + RNAse A）并通过上下吹打混合。将试管置于 55°C 并摇动 1 小时。将试管置于冰上 5 分钟以完全冷却样品。通过设置时程实验来确定超声仪的最佳超声处理条件随着 15 秒脉冲超声循环次数的增加。一定要在两次脉冲之间将样品在冰上孵育 30 秒。通过在 4°C 下在微量离心机中以 18,500 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心管中。按照第 VI 节中的说明，使用 DNA 纯化离心柱或苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀纯化 DNA 样品。从柱子中洗脱 DNA 或将 DNA 沉淀重悬于 30 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。通过电泳确定 DNA 片段大小。在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上加载 > 15 µl 样品。建议使用无染料上样缓冲液（30% 甘油）以更好地观察凝胶上的 DNA 涂片。选择可产生 100-600 bp 最佳 DNA 片段大小的超声处理条件，并用于第 V 节中输入样品的制备，第 4 步。如果未达到最佳超声条件，请增加或减少超声仪的功率设置或超声循环次数，然后重复超声时程实验。附录 C：故障排除指南

有关详细的故障排除指南，请访问https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUN

方案 ID：1884

特异性/灵敏度NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb识别总 NF-κB p65/RelA 蛋白的内源水平。它不会与其他 NF-κB/Rel 家族成员发生交叉反应。物种反应性：

人类、小鼠、大鼠、仓鼠、Monkey, Dog

来源/纯化

使用与人 NF-κB p65/RelA 蛋白的 Glu498 周围残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

转录因子核因子 κB (NF-κB)/Rel 家族在炎症和免疫反应中发挥关键作用 (1,2)。哺乳动物有五个家族成员：RelA、c-Rel、RelB、NF-κB1 (p105/p50) 和 NF-κB2 (p100/p52)。 p105 和 p100 都被蛋白酶体进行蛋白水解处理，分别产生 p50 和 p52。 Rel 蛋白结合 p50 和 p52 形成结合 DNA 并调节转录的二聚体复合物。在未刺激的细胞中，NF-κB 被 IκB 抑制蛋白隔离在细胞质中 (3-5)。 NF-κB 激活剂可诱导 IκB 蛋白的磷酸化，通过泛素-蛋白酶体途径将其靶向快速降解并释放 NF-κB 进入细胞核，在细胞核中调节基因表达 (6-8)。 NIK 和 IKKα (IKK1) 重新调节 NF-κB2 (p100) 的磷酸化和加工以产生 p52，后者易位至细胞核 (9-11)。

Baeuerle, P.A.和 Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol 12, 141-79.Baeuerle, P.A.和 Baltimore, D. (1996) Cell 87, 13-20.Haskill, S. 等人。 (1991) Cell 65, 1281-9.Thompson, J.E. 等人。 (1995) Cell 80, 573-82.Whiteside, S.T.等。 (1997) EMBO J 16, 1413-26.Traenckner, E.B.等。 (1995) EMBO J 14, 2876-83.Scherer, D.C. 等。 (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 11259-63.Chen, Z.J.等。 (1996) Cell 84, 853-62.Senftleben, U. 等人。 (2001) Science 293, 1495-9.Coope, H.J. 等。 (2002) EMBO J 21, 5375-85.Xiao, G. et al. (2001) Mol Cell 7, 401-9.Pathways

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